Metabolism and Pharmacological Characterization at μ-, κ-, and δ- Opioid Receptors Using a Novel Non-Radioactive Assay of Nitazenes and Methadone-like Synthetic Opioids

Novel Synthetic Opioids (NSOs), including nitazenes and diphenylmethylpiperidine derivatives, pose significant challenges to public health due to their high potency, rapid emergence, and limited characterization. This study aims to advance the understanding of their metabolism and pharmacological activity, providing essential tools for detection and risk assessment. Using cryopreserved primary human hepatocytes, Pooled Human Liver Microsomes and LC-HRMS/MS analysis, we characterized the in vitro and in vivo metabolism of etonitazepipne, dipyanone, protonitazepyne, and metonitazepyne. Comprehensive data mining supported by predictive software enabled the identification of key metabolic pathways and biomarkers. The pharmacological characterization of these compounds focused on their activation of the μ-, κ-, and δ-opioid receptors (MOR, KOR, and DOR). A high-throughput HTRF®-based GTP Gi binding assay was developed and optimized to assess their potency and efficacy. As expected, etonitazepipne, protonitazepyne and metonitazepyne shared as main transformation O-dealkylation, hydroxylation and pyrrolidine or piperidine opening to butanoic acid. Dipyanone presented a unique metabolic profile, and the main metabolites were generated after pyrrolidine opening to butanol and butanoic acid followed by cyclisation. As a result of the HTRF®-based GTP Gi binding assay, protonitazepyne was the most potent and efficacious agonist at MOR, resulting around 6 times more potent than fentanyl, followed by etonitazepipne, metonitazepyne and dipyanone. This research provides critical insights into the metabolism and pharmacology of NSOs, proposing unique biomarkers of consumption and a novel, fast and easy HTRF®-based GTP Gi binding assay for receptor activity study.

I nuovi oppioidi sintetici (NSO), inclusi i nitazeni e i derivati della difenilmetilpiperidina, rappresentano sfide significative per la salute pubblica a causa della loro elevata potenza, rapida diffusione e limitata caratterizzazione. Questo studio mira a migliorare la comprensione del loro metabolismo e della loro attività farmacologica, fornendo strumenti essenziali per il rilevamento e la valutazione del rischio. Utilizzando epatociti primari umani e microsomi epatici umani e analisi LC-HRMS/MS, abbiamo caratterizzato il metabolismo in vitro e in vivo di etonitazepipne, dipianone, protonitazepine e metonitazepine. Un’analisi approfondita dei dati, supportata da software predittivi, ha permesso l’identificazione delle principali vie metaboliche e biomarcatori. La caratterizzazione farmacologica di questi composti si è concentrata sulla loro attivazione dei recettori oppioidi μ-, κ- e δ- (MOR, KOR e DOR). È stato sviluppato e ottimizzato un saggio ad alta capacità basato su HTRF® per il legame del GTP Gi, per valutarne la potenza e l’efficacia. Come previsto, etonitazepipne, protonitazepine e metonitazepine hanno condiviso, come principali trasformazioni metaboliche, l’O-dealchilazione, l’idrossilazione e l’apertura del gruppo pirrolidinico o piperidinico in acido butanoico. Il dipianone ha mostrato un profilo metabolico unico, con metaboliti principali generati dopo l’apertura del pirrolidinico in butanolo e acido butanoico, seguita da ciclizzazione. Grazie al saggio HTRF® basato sul legame GTP Gi, il protonitazepine è risultato il più potente ed efficace agonista del MOR, con una potenza circa 6 volte superiore al fentanyl, seguita da etonitazepipne, metonitazepine e dipianone. Questa ricerca fornisce informazioni fondamentali sul metabolismo e sulla farmacologia degli NSO, proponendo biomarcatori unici di consumo e un nuovo saggio HTRF® rapido e semplice per lo studio dell’attività dei recettori.