Mixed fermentations, yeast interactions and metabolites production in industrial fermentations

The Saccharomyces cerevisiae yeast is widely used in the production of fermented beverages such as wine and beer. In this context, selected cultures of S. cerevisiae have developed to be used in these fermentation industries. However, in recent years, the research in winemaking was focused on use of controlled multistarter fermentations by selected cultures of non-Saccharomyces and S. cerevisiae strains, with the aim to obtain products characterized by a more complexity and peculiar sensory characteristics. In this context the present research focused on mixed fermentation and yeast interactions of different non-Saccharomyces yeasts species and S. cerevisiae strains in two different alcoholic beverages: craft beer and wine. In the first part of the thesis has been carried out a molecular characterization of 28 Torulaspora delbrueckii strains, isolated from various natural matrices coming from different environments (Italy and Cameroon), using different PCR-fingerprinting molecular methods: random amplified polymorphic DNA with polymerase chain reaction (RAPD-PCR), minisatellites SED1, AGA1, DAN4 and the newly designed T. delbrueckii (Td)PIR, and microsatellites (GAC)5 and (GTG)5. In this work we found new specific primers pairs (Td)PIR, designed on gene sequence of PIR coding for cell-wall proteins (CWPs), for T. delbrueckii typing. TdPIR3 minisatellite fingerprinting approach proposed in this work, showed high efficacy and discrimination power when compared with RAPD and microsatellites methods, making it particularly useful to T. delbrueckii molecular typing. The second part of the research was focused on the improvement of quality of craft beer. In particular, we have investigated on the dominance and influence of selected S. cerevisiae strains on the analytical profile of craft beer after bottle refermentation and the use of T. delbrueckii selected strains in mixed fermentations to give a peculiar "bioflavour" to the final product. The results showed that selected S. cerevisiae in the refermention process and mixed fermentation (S. cerevisiae / non-Saccharomyces) affected the aromatic composition of beer and could be used to generate distinctive bioflavour. In the third part, we evaluated the behavior of different non-Saccharomyces genera (Candida, Metschnikowia, Torulaspora, Starmerella), and several strains of S. cerevisiae in aerobic and anaerobic condition and different fermentation modalities with the aim to reduce the alcohol content in wine. Non-Saccharomyces yeasts fermentation trials carried out in aerobic and anaerobic condition showed differences in fermentation kinetic, biomass and ethanol production and ethanol yield. Moreover, sequential fermentations using immobilized cells of some non-Saccharomyces yeast strains belonging to Starmerella, Hanseniaspora, Candida, Metschnikowia genera and S. cerevisiae starter strain on synthetic and natural grape juice were carried out. Results showed that the aim to reduce the ethanol concentration of about 2% is attainable, and the different fermentation conditions have effected on the behavior of different yeasts. In the fourth and final part of the study we focused on multistarter fermentations in wine, with the aim to study the kinetics growth, the analytical and aromatic profile of wines. Then were selected different pairs of S. cerevisiae and non-Saccharomyces strains and we studied their interactions on Verdicchio and Montepulciano grape juice. The results showed wines with different analytical and sensorial profiles in comparison with wines obtained with pure fermentation using S. cerevisae commercial starter strains.

Saccharomyces cerevisiae è il lievito principalmente utilizzato nella produzione di bevande fermentate come vino e birra. È in questo contesto che si sono sviluppate colture starter selezionate di ceppi di S. cerevisiae da impiegare in questi settori. Negli ultimi anni però la ricerca, soprattutto in campo enologico, si è concentrata sull’utilizzo di fermentazioni multistarter controllate di lieviti non-Saccharomyces e ceppi di S.cerevisiae, con l’obiettivo di ottenere prodotti caratterizzati da maggiore complessità e caratteristiche sensoriali peculiari. Per tale motivo, la presente ricerca si è incentrata sullo studio di fermentazioni miste e di interazioni tra diverse specie di lievito non-Saccharomyces e S. cerevisiae in due diverse bevande alcoliche: birra artigianale e vino. Nella prima parte della tesi è stata effettuata una caratterizzazione molecolare di 28 ceppi di Torulaspora delbrueckii, isolati da matrici naturali provenienti da diverse aree geografiche (Italia e Camerun), utilizzando differenti metodi molecolari: RAPD-PCR (Random Amplification of Polymorphic DNA), la PCR-fingerprinting con i minisatellites SED1, AGA1, DAN4 e nuovi primers per T. delbrueckii (Td)PIR disegnati in questo laboratorio, e i microsatelliti (GAC)5 and (GTG)5. L’obiettivo del lavoro è quello di utilizzare una nuova coppia di primers (Td)PIR disegnati su sequenze geniche codificanti per proteine di parete (CWPs) per effettuare una tipizzazione di ceppi di T. delbrueckii. L’utilizzo della PCR fingerprinting con il primer TdPIR3 proposto in questo lavoro ha mostrato un’alta efficienza e un alto potere discriminatorio se confrontati con il metodo RAPD e i microsatelliti, il che li rende particolarmente utili per la tipizzazione molecolare di T. delbrueckii. La seconda parte della ricerca è volta a migliorare la qualità della birra artigianale. In particolar modo si sono studiate la dominanza e l’influenza di ceppi selezionati di S. cerevisiae sul profilo analitico di birra artigianale dopo rifermentazione in bottiglia e l’impiego di ceppi di T. delbrueckii in fermentazioni miste per conferire un particolare “bioflavour” al prodotto finito. I risultati ottenuti hanno mostrato come l’impiego di ceppi selezionati di S. cerevisiae nel processo di rifermentazione e le fermentazioni miste (S. cerevisiae / non- Saccharomyces) abbiano effetto sul profilo aromatico della birra e possano quindi essere impiegati per produrre caratteristici bioflavours. Nella terza parte sono stati valutati il comportamento fermentativo di diversi ceppi non-Saccharomyces appartenenti ai generi (Candida, Metschnikowia, Torulaspora, Starmerella), e ceppi di S. cerevisiae in condizioni aerobiche e anaerobiche e differenti modalità fermentative con lo scopo di ridurre il contenuto alcolico nei vini. Fermentazioni condotte con lieviti non-Saccharomyces in condizioni aerobiche ed anaerobiche hanno mostrato differenze nella cinetica fermentativa, produzione di biomassa ed etanolo e rendimento. Inoltre, sono state condotte fermentazioni sequenziali, utilizzando cellule di lievito non-Saccharomyces appartenenti al genere Starmerella, Hanseniaspora, Candida, Metschnikowia in forma immobilizzata e un ceppo starter di S. cerevisiae su mosto sintetico e naturale. I risultati hanno mostrato che l’obiettivo di ridurre il contenuto di etanolo di circa 2% è raggiungibile, e che differenti condizioni fermentative hanno influenza sul comportamento di differenti lieviti. La quarta e ultima parte è stata rivolta allo studio delle fermentazioni multistarter vinarie, andando a studiare la cinetica di crescita, il profilo analitico e aromatico dei vini. Sono state quindi selezionate diverse coppie di ceppi di S.cerevisiae e non-Saccharomyces e si è studiata la loro interazione sia su mosto Verdicchio che su Montepulciano. I risultati ottenuti hanno mostrato prodotti con differenti caratteristiche analitiche e sensoriali da quelli ottenuti in fermentazioni pure con l’utilizzo di ceppi di S. cereviaiae del commercio.