Study of microbial diversity and yeast interactions using molecular methods

Microorganisms play a central role in the regulation of ecosystem processes, and they comprise the vast majority of species on Earth. The aim of this PhD thesis was to improve our knowledge on microbial diversity and dynamics of microbial communities in various conditions and ecological habitats related to environmental and industrial biotechnological processes as well as on the microbial interactions by using molecular and classic methods. In the first part of the present thesis it was evaluated the efficiency of the Mediterranean biomixture (the main part of a biobed) in the degradation of fungicides generally used to control pests in vineyards and to assess their effects on microbial community. Biobeds are biological systems developed all over EU countries to protect water-bodies from pesticide contamination at farm level. Results showed that the biomixture had a good capability of degrading pesticides. Indeed, at the end of the experiment (112 days), the concentration of most of the pesticides was close to complete degradation. Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) analysis showed an evident modification of microbial diversity after the addition of fungicides. However, at the end of degradation process, no significant changes in the composition of microbial community were seen. In the specific substrate used in the biomixture, both yeast flora and ascomycete filamentous fungi seemed to be involved in the degradation activity. In the second part of this PhD thesis it was investigated on the possible use of crude glycerol as a soil amendment. Crude glycerol is a principal by-product of biodiesel production. As the biodiesel industry is rapidly expanding over the last years, a glut of crude glycerol is being created, so there is an urgent need to find alternative uses for this by-product. Considering that crude glycerol is rich in organic compounds, a laboratory experiment was carried out to study the effect of different glycerol amounts on microbial diversity and chemical and biochemical properties of agricultural soil in order to assess the possible agronomical use of crude glycerol without further purification. Results of culture dependent methods showed that the addition of crude glycerol has stimulated the growth of cultivable bacteria and fungi, while DGGE analysis demonstrated that the added glycerol increase bacterial diversity in the soil. Microbial activity in all treated soils reached a steady-state condition in terms of daily respiration activity indicating a positive adaptation of the microbial biomass. This initial investigation showed that the crude glycerol does not seem to have negative effects on the soil but rather causes the development of microbial communities and increases microbial diversity. In the third part of this thesis, the yeast communities colonising grape berry surfaces were evaluated for the influence of fungicide treatments in an organic vineyard (copper/sulphur-based products) and a conventional vineyard (commonly used fungicides). Analysis of yeast abundance and diversity was carried out on grape berries and the grape juice during fermentation, using culture-dependent and -independent approaches. Yeast abundance was as generally reported for mature grapes, with higher counts from grapes treated with conventional fungicides. Direct isolation and DGGE analysis of initial grape samples showed less yeast species diversity in the organic vineyard compared with the conventional vineyard. In the organic and conventional vineyards, the dominant yeasts were Candida zemplinina and Hanseniaspora uvarum, respectively, typical species that colonise surfaces of mature grape berries. Saccharomyces cerevisiae was isolated by traditional methods and detected by DGGE only at the end of fermentation, with lower levels in the organic samples. Moreover, S. cerevisiae showed less intraspecific diversity in the organic samples (two genotypes), in comparison with the conventional samples (six genotypes). Altogether, these results show that the copper and sulphur treatments have greater negative influences on abundance and diversity of grape berry yeast communities (included S. cerevisiae), in comparison with fungicides used for conventional treatments. In the fourth part of the thesis, the attention was focused on the yeast interactions during wine fermentation. The use of a multistarter fermentation process with S. cerevisiae and non Saccharomyces wine yeasts has been proposed to simulate natural must fermentation and to confer greater complexity and specificity to wine. The aim of this work was to study the influence of Starmerella bombicola on S. cerevisiae gene expression and enzymatic activity of pyruvate decarboxylase (Pdc1) and alcohol dehydrogenase (Adh1), the two key enzymes of the alcoholic fermentation pathway. The presence of S. bombicola immobilized cells in a mixed fermentation trial confirmed an increase in fermentation rate, a combined consumption of glucose and fructose, an increase in glycerol and a reduction in the production of ethanol as well as a modification in the fermentation byproducts. Also the alcoholic fermentation of S. cerevisiae was influenced by S. bombicola immobilized cells. Indeed, Pdc1 activity in mixed fermentation was lower than that exhibited in pure culture while Adh1 activity showed an opposite behavior. The expression of both PDC1 and ADH1 genes was highly induced at the initial phase of fermentation which was more evident in mixed culture. S. bombicola immobilized cells greatly affected the fermentation behavior of S. cerevisiae and the analytical composition of wine. The influence of S. bombicola was not limited to a simple additive contribution but its presence caused metabolic modifications during S. cerevisiae fermentation causing variation in the gene expression and enzymatic activity of alcohol deydrogenase and pyruvate decarboxylase.

I microrganismi svolgono un ruolo fondamentale nella regolazione dei vari ecosistemi, rappresentando la maggior parte delle specie sulla Terra. Lo scopo di questa tesi di dottorato è stato quello di migliorare le conoscenze sulla diversità microbica e sulle dinamiche delle comunità microbiche in varie condizioni negli habitat in diversi processi biotecnologici nell ambito ambientale e industriale, nonché sulle interazioni microbiche utilizzando metodologie classiche e molecolari. Nella prima parte è stata valutata l'efficienza dei letti biologici (biobed) in area Mediterranea nella degradazione dei fungicidi generalmente utilizzati nei vigneti valutando gli effetti sulla comunità microbica presente in questo ecosistema. I biobed sono sistemi biologici sviluppati nei paesi UE per proteggere i corpi idrici da contaminazione dei pesticidi a livello aziendale. I risultati hanno mostrato che il biobed ha una buona capacità di degradare i pesticidi. Infatti, alla fine dell'esperimento (112 giorni), la maggior parte dei pesticidi era quasi completamente degradata. Elettroforesi su gel in gradiente denaturante (DGGE) ha mostrato una variazione evidente nella diversità microbica dopo l'aggiunta dei fungicidi. Tuttavia, alla fine del processo di degradazione, nessun cambiamento significativo nella composizione della comunità microbica è stato rilevato. In questo caratteristico substrato utilizzato per allestire il biobed, i lieviti ed i funghi filamentosi ascomiceti sembrano essere i microrganismi maggiormente coinvolti nella attività degradativa. Nella seconda parte di questa tesi di dottorato è stato indagato il possibile impiego del glicerolo grezzo come ammendante nel suolo. Il glicerolo grezzo è il principale sottoprodotto della produzione di biodiesel. L'industria del biodiesel è in rapida espansione negli ultimi anni e sta creando un eccesso di glicerolo grezzo come sottoprodotto. In questo contesto, quindi dobbiamo valutare usi alternativi per questo sottoprodotto. Considerando che il glicerolo grezzo è ricco in composti organici, è stato valutato l'effetto di diverse dosi di glicerolo sulla diversità microbica e sulle proprietà chimiche e biochimiche del terreno agricolo allo scopo di valutare il possibile uso agronomico del glicerolo grezzo, senza una sua ulteriore purificazione. I risultati dei metodi coltura dipendenti hanno mostrato che l'aggiunta di glicerolo grezzo ha stimolato la crescita di batteri e funghi coltivabili, mentre l'analisi DGGE ha mostrato che il glicerolo aggiunto aumenta la diversità batterica nel terreno. L’attività microbica in tutti i suoli trattati ha raggiunto uno stato stazionario in termini di attività respiratoria quotidiana indicando un adattamento positivo della biomassa microbica. Questa indagine iniziale ha mostrato che il glicerolo grezzo non sembra avere effetti negativi sul suolo, ma piuttosto favorisce lo sviluppo delle comunità microbiche e incrementa la diversità microbica. Nella terza parte di questa tesi, è stata valutata l'influenza dei diversi trattamenti antifungini su lieviti che naturalmente colonizzano la superficie della bacca d’uva in un vigneto biologico (prodotti a base di rame/zolfo) e un vigneto convenzionale (fungicidi di uso comune). È stata condotta l’analisi quantitativa e qualitativa di lieviti presenti sulla superficie della bacca e nel succo d'uva durante il processo fermentativo, utilizzando i metodi coltura-dipendenti ed indipendenti. La quantità di lieviti che sono risultati presenti corrisponde al numero generalmente riportato per le uve mature, con un maggiore livello di colonizzazione nei campioni convenzionali rispetto a quelli biologici. L’isolamento diretto e l’analisi della DGGE dei campioni di uva alla fase iniziale di fermentazione hanno mostrato una più bassa diversità di lieviti nel vigneto biologico rispetto a quello convenzionale. Nei vigneti biologici e convenzionali, i lieviti dominanti erano Candida zemplinina e Hanseniaspora uvarum, rispettivamente, le specie tipiche per le superfici di bacche d'uve mature. Saccharomyces cerevisiae è stato isolato usando i metodi tradizionali e la DGGE solo alla fine della fermentazione (dopo autoarricchimento), mostrando livelli più bassi nei campioni biologici. Inoltre, S. cerevisiae ha mostrato una più bassa diversità intraspecifica nei campioni organici (due genotipi), in confronto con i campioni convenzionali (sei genotipi). Complessivamente, questi risultati mostrano che i trattamenti di rame e zolfo hanno una maggiore influenza negativa sui livelli quantitativi e sulla diversità della comunità lievitiforme che colonizza la bacca d’uva (incluso S. cerevisiae), in confronto con fungicidi utilizzati per i trattamenti convenzionali. Nella quarta parte della tesi, l'attenzione è stata focalizzata sulle interazioni tra lieviti durante la fermentazione vinaria. Il controllo di questo processo, da tempo si effettua attraverso l’uso di colture selezionate di S. cerevisiae. Per migliorare la qualità e complessità del vino, recentemente, è stato proposto l’uso di fermentazioni miste controllate, con colture selezionate di S. cerevisiae e non-Saccharomyces. Lo scopo di questa indagine è stato quello di studiare l'influenza di Starmerella bombicola sul ceppo di S. cerevisiae a livello di espressione genica e di'attività enzimatica della piruvato decarbossilasi (Pdc1) e dell’alcool deidrogenasi (Adh1), i due enzimi chiave della fermentazione alcolica. Per fare ciò sono state utilizzate cellule immobilizzate di S. bombicola in fermentazione mista. I risultati hanno confermato un aumento di velocità di fermentazione, un consumo combinato di glucosio e fruttosio, un aumento di produzione del glicerolo, una riduzione della produzione del’etanolo e la modifica di sottoprodotti della fermentazione. Inoltre, S. bombicola in fermentazione mista ha mostrato una forte influenza sulla fermentazione alcolica di S. cerevisiae. Infatti, l’attività di Pdc1 in fermentazione mista è stata inferiore a quella mostrata in coltura pura, mentre l’attività di Adh1 ha mostrato un comportamento opposto. L'espressione dei geni PDC1 e ADH1 era altamente indotta nella fase iniziale di fermentazione ed è stata più evidente nella cultura mista. L'influenza di S. bombicola sembra essere molto complessa e non limitata ad un effetto additivo sulla composizione analitica del vino, ma la sua presenza ha causato modificazioni metaboliche durante la fermentazione di S. cerevisiae determinando variazioni dell'espressione genica e dell'attività enzimatica della piruvato decarbossilasi e alcol deidrogenasi.