Structural Determinants of Kv7.2 Channel Function and Variant-Induced Dysfunction: Insights from Molecular Dynamics Simulations

Voltage-gated potassium channels of the Kv7 (KCNQ) family are sensitive to subtle perturbations at the pore activation gate (AG) and the selectivity filter (SF). This dissertation uses all-atom molecular dynamics (MD) to dissect how four KCNQ2 clinical identified variant remodel gating and permeation: three gain-of-function (GoF) variants in the distal S6 helix (G313S, A317T, L318V) and one loss-of-function (LoF) variant in the pore helix (A265V). Starting from cryo-EM–based closed and open pore models embedded in explicitly solvated membranes, we leverage equilibrium and voltage-driven simulations, as well as force-field cross-checking, to calculate structural features like pore geometry, central-cavity (CC) hydration, SF microstate occupancies, and gate–filter coupling, and to correlate them with variant phenotypes. For the S6 GoF variants, equilibrium MD reveals a consistent loosening of the activation gate in the closed model, in particular at the level of S314/L318 characteristic constrictions, and persistent CC wetting, while the open model remains essentially unchanged. These changes rationalize experimental phenotypes, characterized by a higher open probability with preserved single-channel conductance and membrane abundance. The results are robust against the choice of widely used biomolecular force fields, although the extent of widening and hydration varies. Simulations with applied transmembrane voltages show that the mutated, partially open channels support ion permeation, while the native structure remains nonconducting, consistent with the GoF phyenotype. The SF occasionaly visits narrow, “pinched” conformations, associated with the transient binding of few water molecules behind the SF. At variance with other channels, however, this arrangement is not long-lasting, likely because of unique Kv7.2 sequence features, and the filter prefers conductive conformations harboring multi-ion strings without intercalated waters. The A265V variant has been shown experimentally to induce open-state inactivation in the physiologically non-inactivating Kv7.2 channel. Consistently, simulations of the mutant initiated from an open-gate structure exhibit a slightly dilated and more labile SF that asymmetrically samples non-conductive microstates, accompanied by a modest tightening at the distal S6 gate, a reverse allosteric feature with respect to the GoF variants. Altogether, these results relate each variant to a mechanism supported by consistent structural features: inner-gate dilation that stabilizes opening for GoF S6 substitutions, versus SF-centric lability with reverse coupling for A265V. The work delineates atomistic structure–function relationships in Kv7.2 and offers a systematic framework for interpreting clinical phenotypes and informing pore-targeted modulation.

I canali del potassio voltaggio–dipendenti della famiglia Kv7 (KCNQ) sono sensibili a perturbazioni anche sottili a livello della porta di attivazione del poro (activation gate, AG) e del filtro di selettività (selectivity filter, SF). Questa tesi utilizza simulazioni di dinamica molecolare (MD) all-atomo per analizzare come quattro varianti clinicamente identificate di KCNQ2 rimodellano il gating e la permeazione: tre varianti gain-of-function (GoF) nella porzione distale dell’elica S6 (G313S, A317T, L318V) e una variante loss-of-function (LoF) nell’elica del poro (A265V). A partire da modelli di poro chiuso e aperto basati su strutture crio-EM, inseriti in membrane esplicitamente solvatate, combiniamo simulazioni di equilibrio e sotto voltaggio, insieme a un confronto tra diversi force field, per calcolare caratteristiche strutturali quali la geometria del poro, l’idratazione della cavità centrale (central cavity, CC), le microstati del filtro di selettività e l’accoppiamento tra porta e filtro, e per metterle in relazione con i fenotipi delle varianti. Per le varianti GoF in S6, le simulazioni di equilibrio mostrano un allentamento consistente della porta di attivazione nel modello chiuso, in particolare a livello delle caratteristiche costrizioni S314/L318, e una persistente idratazione della cavità centrale, mentre il modello aperto rimane sostanzialmente invariato. Questi cambiamenti razionalizzano i fenotipi sperimentali, caratterizzati da una maggiore probabilità di apertura a singolo canale e abbondanza di membrana conservate. I risultati risultano robusti rispetto alla scelta di diversi force field biomolecolari ampiamente utilizzati, sebbene l’entità dell’allargamento e dell’idratazione vari. Le simulazioni con differenza di potenziale transmembrana applicata mostrano che i canali mutati, in stato parzialmente aperto, supportano la permeazione ionica, mentre la struttura nativa rimane non conduttiva, in accordo con il fenotipo GoF. Il filtro di selettività visita occasionalmente conformazioni ristrette, “pinched”, associate al legame transiente di poche molecole d’acqua dietro il filtro. A differenza di quanto osservato in altri canali, tuttavia, questa disposizione non è duratura, verosimilmente a causa di caratteristiche di sequenza peculiari di Kv7.2, e il filtro preferisce conformazioni conduttive che ospitano file multi-ione senza acque intercalate. La variante A265V è stata dimostrata sperimentalmente indurre inattivazione in stato aperto nel canale Kv7.2, che in condizioni fisiologiche è considerato non inattivante. Coerentemente, le simulazioni del mutante inizializzate da una struttura con porta aperta mostrano un filtro di selettività leggermente dilatato ma più labile, che campiona in modo asimmetrico microstati non conduttivi, accompagnati da un modesto restringimento della porta distale in S6, una caratteristica di allosteria “inversa” rispetto alle varianti GoF. Complessivamente, questi risultati mettono in relazione ciascuna variante con un meccanismo supportato da caratteristiche strutturali coerenti: dilatazione della porta interna che stabilizza l’apertura per le sostituzioni GoF in S6, rispetto a una labilità centrata sul filtro di selettività con accoppiamento inverso per A265V. Questo lavoro definisce relazioni struttura–funzione a livello atomistico in Kv7.2 e offre un quadro sistematico per interpretare i fenotipi clinici e guidare strategie di modulazione mirata al poro.