EXPLORING EXTRACELLULAR VESICLES AS A NEW APPROACH TO UNDERSTANDING FRAGILE X SYNDROME

Fragile X Syndrome (FXS) is the most common monogenic inherited cause of intellectual disability and represents one of the main genetic conditions associated with autism spectrum disorder. Despite advances in the understanding of the molecular mechanisms underlying FXS, specific biomarkers capable of monitoring disease progression and response to new therapies are still lacking. In recent years, extracellular vesicles (EVs) have emerged as a promising source of biomarkers in neurological disorders, due to their ability to reflect the pathophysiological state of the cells of origin through their protein, lipid and RNA cargo. In this project, we analyzed EVs derived from the plasma of a mouse model of FXS with a dual aim: to optimize extracellular vesicle isolation and to perform an in-depth characterization of their protein and miRNA content in search of potential biomarkers. As a first step, we compared two widely used isolation approaches, size-exclusion chromatography (SEC) and ultracentrifugation followed by iodixanol density gradient (UC-IDG), evaluating yield, purity and enrichment in canonical EV markers, to identify an optimal strategy for analysis of limited biofluid volumes. The vesicles obtained using the selected methodology were isolated from FXS and WT mice plasma and subsequently subjected to proteomic analysis by mass spectrometry and to miRNAs characterization by qRT-PCR of a panel of plasma/serum enriched miRNA. This study represents a first step towards the validation of EVs as a source of reliable biomarkers to assess the efficacy of new therapies in FXS and provides a basis for future integrated studies.

La Sindrome dell’X Fragile (FXS) è la causa ereditaria monogenica più comune di disabilità intellettiva e rappresenta una delle principali condizioni genetiche associate al disturbo dello spettro autistico. Nonostante i progressi nella comprensione dei meccanismi molecolari alla base della FXS, mancano ancora biomarcatori specifici in grado di monitorare la progressione della sindrome e la risposta a nuove terapie. Negli ultimi anni, le vescicole extracellulari (EV) sono emerse come una promettente fonte di biomarcatori nei disturbi neurologici, grazie alla loro capacità di riflettere lo stato fisiopatologico delle cellule di origine attraverso il loro contenuto in proteine, lipidi e RNA. In questo progetto abbiamo analizzato EV derivate dal plasma di un modello murino di FXS, con un duplice obiettivo: ottimizzare l’isolamento delle vescicole extracellulari e caratterizzare in modo approfondito il contenuto di proteine e miRNA alla ricerca di potenziali biomarcatori. Come primo step, abbiamo confrontato due approcci di isolamento ampiamente utilizzati, la cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC) e l’ultracentrifugazione seguita da gradiente di densità con iodixanolo (UC-IDG); valutando resa, purezza e arricchimento in marcatori canonici di EV, al fine di identificare una strategia ottimale per l’analisi di limitate quantità di biofluido. In seguito, le vescicole sono state isolate dal plasma di topi WT ed FXS utilizzando la metodologia risultata più efficiente e sono state sottoposte ad analisi proteomica mediante spettrometria di massa e a valutazione di miRNA tramite qRT-PCR di un pannello di miRNA specificatamente arricchiti nel plasma/siero. Questo studio rappresenta un primo passo verso la validazione delle EV come fonte di biomarcatori affidabili per valutare l'efficacia di nuove terapie nella FXS e fornisce una base per futuri studi integrati.