Insights into the separation, enantioseparation and recognition mechanisms of amphetamine and methamphetamine isotopologues on achiral and polysaccharide-based chiral columns in high-performance liquid chromatography. First Baseline Separation of Isotopomers.

The different behavior of enantiomers of chiral compounds in non-isotropic environments (among them in living organism) is well known. On the other hand, the importance of a kinetic isotope effect in the biomedical field has become evident during past few decades. Thus, separation of both, enantiomers and isotopologues is now critical. Only very few published studies have attempted the simultaneous separation of enantioisotopologues. In this study we report baseline separation of partially deuterated isotopologues of a few amphetamine derivatives in high-performance liquid chromatography (HPLC) using achiral columns. In addition, the simultaneous separations of enantiomers and isotopologues (i.e. enantioisotopologues) were attempted on polysaccharide-based chiral columns. For several compounds the isotope effect was tunable and could be switched from a “normal” to “inverse” by making changes to the mobile-phase composition. A stronger isotope effect was observed in acetonitrile-containing mobile phases compared to methanol-containing ones with both chiral and achiral columns. In a separation system where both “normal” and “inverse” isotope effects were observed the “normal” isotope effect was favored in polar organic solvents while increasing content of the aqueous component in the reversed-phase (RP) mobile phase favored an “inverse” isotope effect. This observation indicates that polar, hydrogen bonding-type noncovalent interactions are involved in the “normal” isotope effect, while apolar hydrophobic-type interactions are mostly responsible for the “inverse” isotope effect. In this study, the feasibility of very challenging separation of isotopomers by high-performance liquid chromatography in a common setup is successfully demonstrated with the examples of deuterated amphetamine and methamphetamine. Understanding the effect of various factors, such as analyte structure, location of heavy atoms within the structure, separation mode (i.e.,surface chemistry of the stationary phase), mobile phase components and their additives, pH of the mobile phase, and separation temperature, that enabled baseline separation of Isotopomers with high selectivity is discussed. The results reported here are significant for both the analytical separation of isotopomers and their preparative-scale separation. The understanding and fine-tuning of the mechanisms underpinning isotopomer retention and discrimination enabled the reversal of isotopomer elution order on specific chiral columns. The simultaneous separation of isotopomers and their enantiomers was observed on polysaccharide-based chiral columns. Molecular modeling was used to provide a reasonable explanation of the separation mechanism of the isotopomers.

Il diverso comportamento degli enantiomeri di composti chirali in ambienti non isotropi (tra questi negli organismi viventi) è ben noto. D'altra parte, l'importanza di un effetto isotopico cinetico nel campo biomedico è diventata evidente negli ultimi decenni. Pertanto, la separazione di entrambi, enantiomeri e isotopologhi, è ora fondamentale. Solo pochissimi studi pubblicati hanno tentato la separazione simultanea degli enantioisotopologhi. In questo studio riportiamo la separazione alla linea di base di isotopologhi parzialmente deuterati di alcuni derivati dell'anfetamina mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) utilizzando colonne achirali. Inoltre, sono state tentate le separazioni simultanee di enantiomeri e isotopologhi (cioè enantioisotopologhi) su colonne chirali a base di polisaccaridi. Per diversi composti l'effetto isotopico era modulabile e poteva essere modificato da “normale” a “inverso” apportando cambiamenti alla composizione della fase mobile. Un effetto isotopico più forte è stato osservato nelle fasi mobili contenenti acetonitrile rispetto a quelle contenenti metanolo, sia con colonne chirali sia con colonne achirali. In un sistema di separazione in cui sono stati osservati sia effetti isotopici “normali” sia “inversi”, l'effetto isotopico “normale” era favorito nei solventi organici polari, mentre l'aumento del contenuto della componente acquosa nella fase mobile in fase inversa (RP) favoriva un effetto isotopico “inverso”. Questa osservazione indica che interazioni non covalenti polari di tipo legame a idrogeno sono coinvolte nell'effetto isotopico “normale”, mentre interazioni apolari di tipo idrofobico sono principalmente responsabili dell'effetto isotopico “inverso”. In questo studio, la fattibilità della molto impegnativa separazione degli isotopomeri mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni in una configurazione comune viene dimostrata con successo attraverso gli esempi di anfetamina e metanfetamina deuterate. Viene discussa la comprensione dell'effetto di vari fattori, quali la struttura dell'analita, la posizione degli atomi pesanti all'interno della struttura, la modalità di separazione (cioè la chimica superficiale della fase stazionaria), i componenti della fase mobile e i loro additivi, il pH della fase mobile e la temperatura di separazione, che hanno consentito la separazione alla linea di base degli isotopomeri con elevata selettività. I risultati qui riportati sono significativi sia per la separazione analitica degli isotopomeri sia per la loro separazione su scala preparativa. La comprensione e la regolazione fine dei meccanismi alla base della ritenzione e della discriminazione degli isotopomeri hanno consentito l'inversione dell'ordine di eluizione degli isotopomeri su specifiche colonne chirali. La separazione simultanea degli isotopomeri e dei loro enantiomeri è stata osservata su colonne chirali a base di polisaccaridi. La modellazione molecolare è stata utilizzata per fornire una spiegazione ragionevole del meccanismo di separazione degli isotopomeri.