Vibrational imaging techniques in teleost fish research: new insights into reproduction and development

Fourier Transform Infrared (FTIR) spectroscopy and Raman Microspectroscopy (RMS) are vibrational techniques which have been revealed in the last ten years as excellent tools to study and characterize the chemical composition of several types of materials/compounds in the different physical states. They have the advantage to be label-free, making them objective and reliable approaches within chemical, biological, and biomedical research fields. Moreover, the coupling of last generation spectrometers with optical microscopes, makes it possible to collect in a few minutes and on the same sample, a great amount of information about the macromolecular composition and the distribution of the most relevant biomolecules (such as proteins, lipids, carbohydrates, and nucleic acids) within the analyzed sample. In fact, each macromolecule shows specific vibrational modes corresponding to transitions from adjacent vibrational energy levels, which are reported as peaks in the IR and Raman spectra: the position, width, and intensity of each peak let obtain a complete information on the molecular composition and structure of the sample. The aim of the present PhD project was to exploit the potential of IR and Raman spectroscopies, in terms of spatial resolution and possibility of obtaining morpho-chemical information, to deepen physiological mechanisms, related to environmental issues, of wild and laboratory model fish species. In particular, the study was focused on: (i) the optimization of a fixation protocol for Raman analysis of fish embryos; (ii) the spectroscopic evaluation of the effects caused by emerging pollutants, such as perfluoroalkyl compounds, on the development of the embryos of the fish model Danio rerio, and (iii) on the possible correlation between the fishing area and the structural organization and the macromolecular composition of Xiphias gladius oocytes, with a particular focus on the Zona Radiata. The advantage of using these spectroscopic approaches respect to routine methodologies (including histology, immunohistochemical and biomolecular assays) relies on the unique possibility given by FTIR and RMS, to provide on the same sample and at the same time, punctual information correlating the structural features with the macromolecular composition.

La Spettroscopia Infrarossa a Trasformata di Fourier (FTIR) e la Microspettroscopia Raman (RMS) sono tecniche vibrazionali estremamente utili per studiare e caratterizzare la composizione chimica di una grande varietà di materiali e composti nei diversi stati fisici. Sia la spettroscopia FTIR che quella Raman non necessitano di specifici label e ciò permette un approccio obiettivo e affidabile per studi nei vari ambiti della chimica e della biologia. Inoltre, grazie all’accoppiamento degli spettrometri di ultima generazione con microscopi ottici, è possibile analizzare sia tessuti che cellule, e ottenere, in una singola analisi e sullo stesso campione, una grande quantità di informazioni sulla composizione biochimica del campione stesso e allo stesso tempo sulla distribuzione delle più rilevanti biomolecole (ad es. proteine, lipidi, carboidrati e acidi nucleici). Infatti, ciascuna macromolecola mostra specifici modi vibrazionali che corrispondono a transizioni tra livelli vibrazionale adiacenti, che vengono riportati come picchi negli spettri Infrarosso e Raman: la posizione, la larghezza e l'intensità di ciascun picco consentono di ottenere informazioni complete sulla composizione molecolare e sulla struttura del campione. Lo scopo di questo progetto di dottorato è stato utilizzare le potenzialità della Microspettroscopia Raman e della spettroscopia FTIR Imaging, in termini di risoluzione spaziale e informazioni morfo chimiche a livello molecolare, per approfondire specifici meccanismi fisiologici di specie ittiche sia wild che specie modello. In particolare, lo studio si è concentrato: (i) sulla valutazione degli effetti causati da inquinanti emergenti come i composti perfluoroalchilici sullo sviluppo di embrioni della specie modello Danio rerio, e (ii) sulla ricerca di una correlazione fra le caratteristiche strutturali e macromolecolari di ovociti di Xiphias gladius con particolare attenzione alla zona pellucida e l’area di pesca. Il vantaggio di utilizzare un approccio spettroscopico rispetto alle metodologie normalmente impiegate (comprese le analisi istologiche, immunoistochimiche e biomolecolari) si basa sulla possibilità unica data da queste tecniche vibrazionali di fornire sullo stesso campione e allo stesso tempo, informazioni puntuali che correlano le caratteristiche strutturali con la composizione macromolecolare del campione.