Profiling of in vitro metabolism of New Psychoactive Substances

A New Psychoactive Substance (NPS) is defined by United Nation Office of Drugs and Drug Addiction (UNODC) as a “substance of abuse, either in a pure form or a preparation, that is not controlled by the 1961 Single Convention on Narcotic Drugs or the 1971 Convention on Psychotropic Substances, but which may pose a public health threat”. To date, more than 1,100 molecules have been identified as NPS in the illicit market and every year a variable number of new alternatives appears for the first time. The mutating nature of the NPS market represents one of the most challenging aspects of the fight against this public health issues because little is known about the toxicological profile of these substances when they appear for the first time. To this concern, the in vitro metabolic studies are considered the first step in the understanding of the pharmacology of NPS, allowing the individuation of possible biomarkers of consumption. We studied the in vitro metabolism of three different NPS, two fentanyl analogues and one synthetic cathinone, in two different incubation batches according to a consolidated protocol. First, we studied phenylfentanyl and b’-phenylfentanyl metabolic fate using in silico predictions with GLORYx freeware, human hepatocyte incubations, and liquid chromatography-high-resolution tandem mass spectrometry (LC-HRMS/MS). We applied a specific targeted/untargeted workflow using data-mining software to allow the rapid and partially automated screening of LC-HRMS/MS raw data. Although the similar structure of phenylfentanyl and b’-phenylfentanyl, we observed several differences in the metabolic fate of the two analogues. The first difference is in the number of metabolites, in fact we characterized 13 phenylfentanyl metabolites and 27 b’phenylfentanyl metabolites. Furthermore, the in vitro formation of 4-anilino-phenethylpiperidine, one of the most common fentanyl analogue metabolites, was observed only for phenylfentanyl. The hydroxylation reactions were preferred for b’phenylfentanyl, targeting the lateral alkyl chain and the phenyl rings. Moreover, phase II metabolites were found only in b’-phenylfentanyl, such as glucuronides and O-methylated metabolites. However, the most intense signal was produced by the N-dealkylated metabolite, the so called nor-metabolites, in both the chromatographic separations. The differences in the metabolic fate suggest an important role of the lateral alkyl chain of fentanyl analogues. An extended in silico metabolic prediction strategy was applied for the prediction of 3fuoro-a-pyrrolidovalerophenon (3f-a-PVP), using three specific freeware to obtain a more comprehensive prediction. The same analytical and data-mining strategy was then applied for the 3f-a-PVP study. The same analytical strategy and data-mining approach was successfully applied to investigate the metabolites produced during the incubations. Ten metabolites were identified after 3 h incubation, including hydrogenated, hydroxylated, oxidated, and N-dealkylated metabolites. A total of 51 phase I and II metabolites were predicted, among which 7 were detected in the incubations. We suggest 3F-α-PVP N-butanoic acid, 3F-α-PVP pentanol, and 3F-α-PVP 2-ketopyrrolidinyl-pentanol as specific biomarkers of 3F-α-PVP consumption. This is the first time that an N-ethanoic acid is detected in the metabolic pathway of a pyrrolidine SC, demonstrating the importance of a dual targeted/untargeted data mining strategy.

Una nuova sostanza psicoattiva (NPS) è definita dall'Ufficio delle droghe e delle tossicodipendenze delle Nazioni Unite (UNODC) come una "sostanza di abuso, in forma pura o in un preparato, che non è controllata dalla Convenzione unica sugli stupefacenti del 1961 o la Convenzione del 1971 sulle sostanze psicotrope, ma che possono rappresentare una minaccia per la salute pubblica”. Ad oggi sono più di 1.100 le molecole identificate come NPS nel mercato illecito e ogni anno compare per la prima volta un numero variabile di nuove alternative. La natura mutante del mercato delle NPS rappresenta uno degli aspetti più impegnativi della lotta contro questi problemi di salute pubblica perché poco si sa circa il profilo tossicologico di queste sostanze quando compaiono per la prima volta. A tal proposito, gli studi metabolici in vitro sono considerati il primo passo nella comprensione della farmacologia delle NPS, consentendo l'individuazione di possibili biomarcatori di consumo. Abbiamo studiato il metabolismo in vitro di tre diverse NPS, due analoghi del fentanil e un catinone sintetico, in due diversi lotti di incubazione secondo un protocollo consolidato. In primo luogo, abbiamo studiato il destino metabolico del fenilfentanil e del b'-fenilfentanil utilizzando previsioni in silico con freeware GLORYx, incubazioni di epatociti umani e spettrometria di massa tandem ad alta risoluzione per cromatografia liquida (LC-HRMS/MS). Abbiamo applicato uno specifico flusso di lavoro mirato/non mirato utilizzando un software di data mining per consentire lo screening rapido e parzialmente automatizzato dei dati grezzi LC-HRMS/MS. Sebbene la struttura simile di fenilfentanil e b'-fenilfentanil, abbiamo osservato diverse differenze nel destino metabolico dei due. La prima differenza è nel numero di metaboliti, infatti abbiamo individuato 13 metaboliti del fenilfentanil e 27 metaboliti del b'fenilfentanil. Inoltre, la formazione in vitro di 4-anilino-fenetilpiperidina, uno dei più comuni metaboliti dell'analogo del fentanil, è stata osservata solo per il fenilfentanil. Le reazioni di idrossilazione sono state preferite per il b'fenilfentanil, mirando alla catena alchilica laterale e agli anelli fenilici. Inoltre, i metaboliti di fase II sono stati trovati solo nel b'-fenilfentanil, come i glucuronidi e i metaboliti O-metilati. Tuttavia, il segnale più intenso è stato prodotto dal metabolita N-dealchilato, i cosiddetti nor-metaboliti, in entrambe le separazioni cromatografiche. Le differenze nel destino metabolico suggeriscono un ruolo importante della catena alchilica laterale degli analoghi del fentanil. È stata applicata una strategia di previsione metabolica estesa in silico per la previsione del 3fuoro-a-pyrrolidovalerophenon (3f-a-PVP), utilizzando tre software gratuiti specifici per ottenere una previsione più completa. La stessa strategia analitica e di data mining è stata quindi applicata per lo studio 3f-a-PVP. La stessa strategia analitica e l'approccio di data mining sono stati applicati con successo per studiare i metaboliti prodotti durante le incubazioni. Dieci metaboliti sono stati identificati dopo 3 ore di incubazione, inclusi metaboliti idrogenati, idrossilati, ossidati e N-dealchilati. Sono stati previsti un totale di 51 metaboliti di fase I e II, di cui 7 sono stati rilevati nelle incubazioni. Suggeriamo acido N-butanoico 3F-α-PVP, pentanolo 3F-α-PVP e 2-ketopirrolidinil-pentanolo 3F-α-PVP come biomarcatori specifici del consumo di 3F-α-PVP. Questa è la prima volta che un acido N-etanoico viene rilevato nella via metabolica di una pirrolidina SC, dimostrando l'importanza di una doppia strategia di data mining mirata/non mirata.