Self-assembling properties of mono and dirhamnolipids and their interactions with model membranes

My thesis reports an extensive biophysical study of the two categories of molecules that compose biosurfactant rhamnolipid (RL): mono and di-rhamnolipids. Understanding the differences in chemical and physical properties of mono and di-RL is important because their applications as emulsifying and dispersing agents in bioremediation processes and other biotechnological sectors. My work started with the chemical separation of mono and di-RL from the commercial mixture (RLs) using silica gel column chromatography, confirmed by electrospray mass spectroscopy. I performed surface tension measurements to determinate the CMC of each of them. The physical chemical characterization started using X-ray diffraction on samples of mono and di-RL in concentrated water solutions ranging from 10 to 45 w/w%. This technique allows to determine the characteristic lyotropic polymorphism, as well as the molecular packing and properties at a few Å. To derive the structural properties in dilute solutions, mono or di-RL samples dissolved from 10 to 100 mM in water were analyzed by SAXS at the Diamond synchrotron. Results allowed to characterize different micellar structures formed by mono and di-RL. I studied the interactions between model membranes with mono and di-RL, showing how it is possible, by assuming a kinetic model, to derive relevant physical parameters from optical microscopy images. I performed phase contrast and fluorescence microscopy experiments on plasma membrane models represented by Giant Unilamellar Vesicles (GUVs), composed of single lipid POPC and ternary GUVs DOPC:SM:CHOL in molar ratios 1:1:1, 3:5:2 and 5:3:2. The experiments were performed with GUVs in the presence of mono- or di-RL in 0.06, 0.12 and 0.25 mM concentrations. Novel methods have been developed and applied to microscopy images allowing to determine area and volume of GUVs with asymmetrical shape and the description of the GUV-RL interaction by two kinetic mechanisms, RL-insertion and pore formation.

La mia tesi riporta un studio biofisico sui mono-ramnolipidi e i di-ramnolipidi, i principali gruppi di molecole di ramnolipidi (RL), una classe di tensioattivi biologici. Comprendere le differenze nelle proprietà chimiche e fisiche dei mono-RL e di-RL è importante per lo sviluppo delle loro potenziali applicazioni, ad esempio come agenti emulsionanti e disperdenti nei processi di biorisanamento. Ho svolto la separazione di mono e di-RL da una miscela commerciale di RL mediante cromatografia su colonna di gel di silice. Ho eseguito misure della tensione superficiale per determinare la CMC dei due componenti. La caratterizzazione strutturale è stata condotta a partire da misure di diffrazione dei raggi X (XRD) su campioni di mono e di-RL in soluzioni acquose concentrate, tra il 10 e il 45 w/w%. Questa tecnica consente di determinare il caratteristico polimorfismo liotropico a risoluzione spaziale di pochi Å. Per derivare le proprietà strutturali in soluzioni diluite, campioni di mono e di-RL sono stati studiati mediante misure di diffusione a piccolo angolo dei raggi X (SAXS), condotte presso il sincrotrone Diamond. I risultati hanno permesso di caratterizzare le strutture micellari formate dai due componenti. Ho studiato le interazioni tra membrane modello con mono e di-RL, mostrando come sia possibile, assumendo un modello cinetico, derivare parametri fisici rilevanti da immagini di microscopia ottica. Ho eseguito esperimenti di microscopia a contrasto di fase e a fluorescenza su vescicole unilamellari giganti (GUV) composte dal lipide POPC e ternarie DOPC:SM:CHOL, in differenti rapporti, molari con mono o di-RL in concentrazioni di 0.06, 0.12 e 0.25 mM. Ho sviluppato e applicato metodi originali per interpretare le immagini di microscopia, i quali hanno consentito la determinazione dell'area e del volume di GUV asimmetriche e la descrizione dell'interazione GUV-RL in termini di due meccanismi cinetici, l’inserimento nel foglietto lipidico e la formazione dei pori.