Effects of probiotics and micronutrients on zebrafish skeletal development and in vitro cell culture

Micronutrients such as Boron (B) and Selenium (Se) are previously known to be playing key roles in ossification process but their interactions with VD is poorly explored. Probiotics are microbes known to exert beneficial effects on the host when supplied in adequate quantities. This research thesis aim to explore the osteogenic actions of B and Se, and selected probiotics strains. Specific zebrafish osteoblast reporter lines combined with transcriptomic analysis and hFOB1.19 cell line were used to explore the mechanism of actions. MAPK was confirmed as the most regulated pathway by the B and VD synergy groups in addition to TGF-β signaling, focal adhesion and calcium signaling in zebrafish larvae. By adding low concentrations of additional micronutrients, the results help broaden the therapeutic options for treating pathological conditions caused by VD deficiency. Probiotic treatment was found to accelerate the caudal fin regeneration in zebrafish confirmed by the upregulation of key marker genes and increased phosphates found by FTIRI analysis at 5 days post amputation (DPA) fins. Furthermore, to investigate the effects of two probiotics, Bacillus subtilis and Lactococcus lactis, on osteoblast formation and extracellular matrix mineralization, we created two new zebrafish transgenic lines containing fluorescent protein coding sequences inserted into endogenous genes for sp7 and col10a1a, that display fluorescence in developing osteoblasts and bone extracellular matrix, respectively. When larvae were exposed to a BMP inhibitor, B.subtilis was the most potent probiotics in recovering the bones from the detrimental effects caused by the BMP inhibitor. Additionally, experiments on hFOB1.19 cells revealed that B.subtilis extract significantly increased ALP levels via staining, western blot, and immunofluorescence. We also confirmed the suitability of in vitro cell culture systems to test probiotic effects by using probiotic extracts instead of live cells.

Studi pregressi hanno mostrato che i micronutrienti come il boro (B) e il selenio (Se) e la vitamina D (VD) svolgono un ruolo chiave nel processo di ossificazione, tuttavia l’effetto delle interazioni fra queste diverse molecole, soprattutto a livello osseo, sono ancora poco conosciute. Inoltre, è nota la capacità dei probiotici di esercitare effetti benefici sull'organismo ospite. Lo scopo di questa tesi di dottorato è quindi quello di valutare l’effetto della somministrazione di B e Se e ceppi di probiotici sul processo di ossificazione e sul metabolismo osseo. I risultati ottenuti utilizzando specifiche linee reporter di osteoblasti di pesce zebra, la linea cellulare hFOB1.19 e l’integrazione delle evidenze ottenute con le analisi di trascrittomica hanno permesso di andare a fondo sui meccanismi attivati dalla sommistrazione dei diversi microelementi sul metabolismo osseo. Nelle larve di pesce zebra quello delle MAPK è risultato il pathway più regolato dalla co-somministrazione di B e VD, oltre alla segnalazione del TGF-β, all'adesione focale e alla segnalazione del calcio. Ciò ha suggerito che l’aggiunta di basse concentrazioni di micronutrienti alla dieta, può fornire un valido aiuto e ampliare le opzioni terapeutiche per il trattamento di condizioni patologiche causate da carenza di VD. Inoltre, il trattamento con i probiotici accelera la rigenerazione della pinna caudale nel pesce zebra, come suggerito dalla sovra-espressione di geni biomarker del sistema osseo e dall'aumento del contenuto dei fosfati misurato dall'analisi FTIRI a 5 giorni dopo l'amputazione (DPA) delle pinne. Inoltre, al fine di analizzare gli effetti di due ceppi probiotici, Bacillus subtilis e Lactococcus lactis, sulla formazione di osteoblasti e sulla mineralizzazione della matrice extracellulare, abbiamo creato due nuove linee transgeniche di pesce zebra contenenti sequenze codificanti proteine fluorescenti inserite nei geni che codificano per sp7 e col10a1a, in modo da poter marcare, rispettivamente lo sviluppo degli osteoblasti e della matrice extracellulare ossea. L’uso di queste linee transgeniche ci ha permesso di verificare che B.subtilis è stato il probiotico che ha permesso di recuperare al meglio recuperare gli effetti dannosi causati dall'inibitore del BMP. Inoltre, esperimenti sulle cellule hFOB1.19 hanno rivelato che l’esposizione all'estratto di B.subtilis ha aumentato significativamente i livelli di ALP. Inoltre, è stata anche confermata la validità dell’uso dei sistemi di coltura cellulare in vitro per testare gli effetti dei probiotici, utilizzando estratti batterici in alternativa alla somministrazione di cellule vive.