Metilazione e cambiamenti di espressione delle LINE1 associati alla senescenza replicativa delle cellule endoteliali umane e dei fibroblasti dermici

Aging is characterized by a morpho-functional adaptation, variably affecting major physiological systems, depending on a complex interaction between genetic, environmental and stochastic factors. One of the main challenge of the research on aging is to explain how cellular mechanisms can affect the complex phenomena observed during organismal aging. In this framework, a better understanding of the epigenetic mechanisms involved in the acquisition of the senescent phenotype, could help to underpinn the key features of aging process and age-related diseases development. We firstly analysed DNA methylation status of genome in young and senescent endothelial cells (HUVECs). This analysis hightlighted that senescent HUVECs were characterizated by increased levels od demethylated sequences, located in regions with low gene density. Since genomic regions with mild-low gene density could be enriched of retrotransportable elements (TEs), both short (SINE) and long interspersed elements (LINE), that can contribute to genomic instability via retrotransposition and induction of double strand breaks. TEs activation could be a molecular mechanisms promoting or affecting cellular senescence. Based on this assumption, we studied TEs activation in two different cell types, such as endothelial cells (HUVECs) and fibroblasts (NHDF). We focused our analysis on some LINE subfamily, such as L1PA2, and on some SINE subfamily, like Alu, that require L1 ORF2 protein for the retrotrasposition. The analysis of the RNA expression revealed a significant increase of both Alu and ORF2 in senescent HUVEC and NHDF. Since an increase in TEs copies in the nucleus could indicate an increase of the integrated sequences, while an increased amount of TEs DNA in the cytoplasm should indicate an increase in the retrotransscription process, which proceeds through a cDNA intermediate, we analysed also the cellular localization of the ssDNA derived from retrotrasposable activity. Significant reduction of DNA sequences of L1PA2, Alu and ORF2 was observed in the nuclear fractions of senescent HUVECs, whereas in NHDF nucler fraction of senescent cells only a significant reduction of L1PA2 was observed. Interestingly, a significant increased of DNA sequences derived from Alu, ORF2 and even L1PA2 was observed in the cytoplasmatic fractions, both in HUVEC and NHDF cells. The increased amount of L1PA2 cDNA sequences not associated with increased mRNA, suggests a complex mechanism in the retrotrascription of TEs in senescent cells. Finally, the increased amount of cytoplasmatic nucleic acids derived from TEs in senescent cells should contribute to activate the cytoplasmic sensors inducing antivilar response and INF1 synthesis. Surprisingly, senescent NHDF showed increased INF1 expression, as predicted, whereas in senescent HUVECs INF1 expression was not significantly modulated. This result, suggest that some cell types, i.e. endothelial cells, could be “tolerant” during senescence to the increased amount of misplaced cytosolic nucleic acids, becoming more susceptible to viral infections.

L'invecchiamento è caratterizzato da un adattamento morfo-funzionale, che influenza variamente i principali sistemi fisiologici, a seconda di una complessa interazione tra fattori genetici, ambientali e stocastica. Una delle principali sfide della ricerca sull'invecchiamento è spiegare come i meccanismi cellulari possono influenzare i fenomeni complessi osservati durante l'invecchiamento dell'organismo. In questo quadro, una migliore comprensione dei meccanismi epigenetici coinvolti nell'acquisizione del fenotipo senescente, potrebbe contribuire a sostenere le caratteristiche chiave del processo di invecchiamento e dello sviluppo delle malattie legate all'età. In primo luogo, abbiamo analizzato lo stato di metilazione del DNA del genoma nelle cellule endoteliali giovani e senescenti (HUVEC). Questa analisi ha fatto luce sul fatto che gli HUCOV senescenti sono stati caratterizzati da maggiori livelli di sequenze demetilate, situate in regioni a bassa densità genica. Poiché le regioni genomiche a bassa densità genica potrebbero essere arricchite da elementi retrotrasportabili (E), sia elementi brevi (SINE) che lunghi intervallati (LINE), che possono contribuire all'instabilità genomica attraverso la retrotrasposizione e l'induzione di rotture a doppio filamento. L'attivazione delle TE potrebbe essere un meccanismi molecolare che promuovono o influenzano la senescenza cellulare. Sulla base di questo presupposto, abbiamo studiato l'attivazione delle UTE in due diversi tipi di cellule, come le cellule endoteliali (HUVEC) e i fibroblasti (NHDF). Abbiamo concentrato la nostra analisi su alcune sottofamiglia LINE, come L1PA2, e su alcune sottofamiglia SINE, come Alu, che richiedono proteine L1 ORF2 per la retrotrasposizione. L'analisi dell'espressione dell'RNA ha rivelato un significativo aumento sia di Alu che di ORF2 in HUVEC e NHDF senescenti. Poiché un aumento delle copie di TE nel nucleo potrebbe indicare un aumento delle sequenze integrate, mentre una maggiore quantità di DNA di TE nel citoplasma dovrebbe indicare un aumento del processo di retrotrascrizione, che procede attraverso un intermedio cDNA, abbiamo analizzato anche la localizzazione cellulare della ssDNA derivata dall'attività retrotrasponibile. Una significativa riduzione delle sequenze di DNA di L1PA2, Alu e ORF2 è stata osservata nelle frazioni nucleari degli HUVEC senescenti, mentre nella frazione nucler NHDF delle cellule senescenti è stata osservata solo una significativa riduzione dell'L1PA2. È interessante notare che nelle frazioni cimalasmatiche, sia nelle cellule HUVEC che NHDF, è stato osservato un aumento significativo delle sequenze di DNA derivate da Alu, ORF2 e persino L1PA2. L'aumento della quantità di sequenze di cDNA L1PA2 non associate all'aumento dell'mRNA, suggerisce un meccanismo complesso nella retrotrascrizione delle TE nelle cellule senescenti. Infine, l'aumento della quantità di acidi nucleici cimalasmatici derivati dalle TE nelle cellule senescenti dovrebbe contribuire ad attivare i sensori citoplasmatici che inducono risposta antivilare e sintesi INF1. Sorprendentemente, l'NHDF senescente ha mostrato un aumento dell'espressione INF1, come previsto, mentre negli HUVEC senescenti l'espressione INF1 non è stata significativamente modulata. Questo risultato, suggeriscono che alcuni tipi di cellule, cioè le cellule endoteliali, potrebbero essere "tolleranti" durante la senescenza all'aumento della quantità di acidi nucleici citosolici fuori luogo, diventando più suscettibili alle infezioni virali.