Sviluppo e validazione di un saggio in real-time pcr per la determinazione della quantità e qualità del dna nucleare e mitocondriale umano e le sue applicazioni nelle analisi forensi

Quantification of human DNA plays a key role in forensic genetics. A more accurate estimate of the amount of human DNA is essential for planning and optimizing genotyping assays, as is an evaluation of the presence of PCR inhibitory substances present in forensic samples. Furthermore, for highly compromised samples, quantification can provide information about the DNA degradation status, directing the forensic analyst towards more appropriate genotyping strategies. In this study, we present a Real-Time PCR assay (qPCR TaqMan®) for the quantification of DNA specific for forensic applications, able to assess simultaneously both the quantity of nuclear and mitochondrial DNA. The assay combines two mtDNA targets and two nuclear DNA targets, with amplification products of different sizes (mtDNA=69bp and 143bp; nuclear DNA=71bp and 181bp), in order to provide information on the degradation status of the extracted genetic material. In addition, the qPCR test contains an internal positive control (IPC) to detect the presence of potential inhibitors. However, due to an interaction between the 69bp mitochondrial target primers and the 71bp nuclear target probe, found during validation and optimization of the qPCR assay, the 71bp DNA target was removed from the assay passing from pentaplex to tetraplex reaction. The assay was tested on various biological matrices, consisting of forensic samples that contain small amounts of nuclear DNA and/or degraded DNA, such as bone, teeth, fingernails, formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues and hair shafts. The quantification results obtained by the tetraplex assay have been compared with the data achieved on the same samples with other quantification systems commercially available and commonly used in forensic genetics laboratories.

La quantificazione del DNA umano ha un ruolo molto importante nella genetica forense. Una stima quanto più accurata della quantità di DNA umano è indispensabile per una pianificazione e un’ottimizzazione delle reazioni di genotipizzazione, così come è altrettanto utile una valutazione della presenza di sostanze inibitrici della reazione di PCR presenti nei campioni forensi. Inoltre, per campioni altamente compromessi, la quantificazione può fornire informazioni sullo stato di degradazione del DNA, indirizzando l'analista forense verso strategie di genotipizzazione più opportune. In questo studio, presentiamo un test in Real-Time PCR (qPCR TaqMan®) per la quantificazione del DNA specifico per applicazioni forensi, in grado di valutare simultaneamente sia la quantità di DNA nucleare che di DNA mitocondriale (mtDNA). Il saggio combina due target mtDNA e due target di DNA nucleare, con prodotti di amplificazione di dimensioni diverse (mtDNA=69bp e 143bp; DNA nucleare=71bp e 181bp), così da fornire informazioni sullo stato di degradazione del materiale genetico estratto. Inoltre, il test qPCR contiene un controllo positivo interno (IPC) per rilevare la presenza di potenziali inibitori. Tuttavia, a causa di un'interazione tra i primers del target mitocondriale da 69bp e la sonda del target nucleare da 71bp, riscontrata durante la validazione e l'ottimizzazione del saggio qPCR, è stato eliminato dal saggio il target da 71bp del DNA nucleare passando da una reazione pentaplex ad una reazione tetraplex. Il saggio è stato testato su diversi matrici biologiche, costituite da campioni forensi contenenti esigue quantità di DNA nucleare e/o DNA degradato, come ossa, denti, unghie, tessuti fissati in formalina e inclusi in paraffina (FFPE) e fusti dei capelli. I risultati di quantificazione ottenuti mediante il saggio tetraplex sono stati confrontati con i dati ottenuti sugli stessi campioni con altri sistemi di quantificazione esistenti in commercio e di uso comune nei laboratori di genetica forense.