In recent years, the production of recombinant proteins has become a basic tool for structural and biophysical studies but also for therapeutic and biotechnological applications. For this reason, innovative studies and approaches are necessary for the optimization of the expression, purification and characterization of these proteins. In particular, the work documented in this thesis focuses on the optimization of the production of the human hemoglobin receptor (aka CD163) and the SARS-CoV-2 Main protease (aka Mpro). The human hemoglobin receptor, aka CD163, is a multifunctional endocytic receptor and is characterized by a repetition of the cysteine-rich scavenger receptor (SRCR). It is known to play a critical role in various physiological and pathological pathways. However, the structural and functional details of this protein have not yet been elucidated, even less so if taken into the complex mechanism of interaction with its ligand (Hb-Hp complex). In this study, CD163 was recombinantly produced in two different eukaryotic expression systems: Mammalian cells and Insect cells. The recombinant CD163 produced in both expression systems used, is homogeneous after purification both by metal affinity chromatography and by size exclusion. The Baculovirus system, however, seems to allow a higher protein expression yield: it is therefore more suitable for large-scale production. Subsequent studies have shown that the physiological link of recombinant CD163 with the Hp-Hb complex is not stable and is not quantitatively relevant. Initially, the ligand-receptor complex seems to form, but the investigations carried out with dynamic light scattering show two distinct populations of molecules within the solution. This result lays the foundation for further deepening the understanding of the binding mechanism between recombinant CD163 and the hp-Hb complex. The calorimetric analysis conducted on the individual components of the ternary complex did not reveal any structural or folding problems. Further analyzes are necessary in order to better understand and solve the complex. Cryoelectronic microscopy studies were initially planned but at the moment it has not yet been possible to carry out them due to the spread of the new coronavirus (SARS-CoV-2). The sudden development of the Covid 19 pandemic has shifted the focus of the research work I have done in the last year on the main protease of this coronavirus. The maturation of SARS-CoV-2, in fact, requires a main protease (Mpro) to cleave the polyproteins encoded by the virus. Despite a large amount of experimental information already available, there is wide disagreement on the equilibrium monomer-dimer dissociation constant Mpro. Since the functional unit of Mpro is a homodimer, detailed knowledge of the thermodynamics of this equilibrium is key information for a possible therapeutic intervention, with small molecules interfering with dimerization being potential conductors of broad spectrum antiviral drugs. With small angle X-ray scattering (SAXS) the structural characteristics of the monomer-dimer equilibrium of SARS-CoV-2 Mpro were determined, revealing the corresponding equilibrium dissociation constant and associated thermodynamic parameters. The same technique was used to study how the dissociation process of Mpro is influenced by small inhibitors selected through combinatorial design. The results show that it is not possible to provide a clear picture linking the ability of inhibitors to interrupt the dimerization of Mpro with the loss of catalytic activity, thus highlighting the possible role of allosteric effects for the regulation of Mpro functionality.

Negli ultimi anni la produzione di proteine ​​ricombinanti è diventata uno strumento fondamentale per studi strutturali e biofisici ma anche per applicazioni terapeutiche e biotecnologiche. Per questo motivo sono necessari studi e approcci innovativi per l'ottimizzazione dell'espressione, purificazione e caratterizzazione di queste proteine. In particolare, il lavoro documentato in questa tesi si concentra sull'ottimizzazione della produzione del recettore dell'emoglobina umana (aka CD163) e della proteasi principale SARS-CoV-2 (aka Mpro). Il recettore dell'emoglobina umana, noto anche come CD163, è un recettore endocitico multifunzionale ed è caratterizzato da una ripetizione del recettore scavenger ricco di cisteina (SRCR). È noto per svolgere un ruolo critico in vari percorsi fisiologici e patologici. Tuttavia, i dettagli strutturali e funzionali di questa proteina non sono stati ancora chiariti, ancor meno se presi nel complesso meccanismo di interazione con il suo ligando (complesso Hb-Hp). In questo studio, CD163 è stato prodotto in modo ricombinante in due diversi sistemi di espressione eucariotica: cellule di mammiferi e cellule di insetti. Il CD163 ricombinante prodotto in entrambi i sistemi di espressione utilizzati, risulta omogeneo dopo purificazione sia mediante cromatografia di affinità metallica che per esclusione dimensionale. Il sistema Baculovirus, invece, sembra consentire una maggiore resa di espressione proteica: è quindi più adatto a produzioni su larga scala. Studi successivi hanno dimostrato che il legame fisiologico del CD163 ricombinante con il complesso Hp-Hb non è stabile e non è quantitativamente rilevante. Inizialmente, il complesso ligando-recettore sembra formarsi, ma le indagini effettuate con la diffusione dinamica della luce mostrano due distinte popolazioni di molecole all'interno della soluzione. Questo risultato pone le basi per approfondire ulteriormente la comprensione del meccanismo di legame tra CD163 ricombinante e il complesso hp-Hb. L'analisi calorimetrica condotta sui singoli componenti del complesso ternario non ha evidenziato problemi strutturali o di piegatura. Ulteriori analisi sono necessarie per comprendere e risolvere meglio il complesso. Inizialmente erano previsti studi di microscopia crioelettronica ma al momento non è stato ancora possibile effettuarli a causa della diffusione del nuovo coronavirus (SARS-CoV-2). L'improvviso sviluppo della pandemia di Covid 19 ha spostato il focus del lavoro di ricerca che ho svolto nell'ultimo anno sulla principale proteasi di questo coronavirus. La maturazione di SARS-CoV-2, infatti, richiede una proteasi principale (Mpro) per scindere le poliproteine ​​codificate dal virus. Nonostante una grande quantità di informazioni sperimentali già disponibili, vi è ampio disaccordo sulla costante di dissociazione di equilibrio monomero-dimero Mpro. Poiché l'unità funzionale di Mpro è un omodimero, la conoscenza dettagliata della termodinamica di questo equilibrio è un'informazione chiave per un possibile intervento terapeutico, con piccole molecole che interferiscono con la dimerizzazione essendo potenziali conduttori di farmaci antivirali ad ampio spettro. Con lo scattering di raggi X a piccolo angolo (SAXS) sono state determinate le caratteristiche strutturali dell'equilibrio monomero-dimero di SARS-CoV-2 Mpro, rivelando la corrispondente costante di dissociazione dell'equilibrio e i parametri termodinamici associati. La stessa tecnica è stata utilizzata per studiare come il processo di dissociazione di Mpro sia influenzato da piccoli inibitori selezionati attraverso il disegno combinatorio. I risultati mostrano che non è possibile fornire un quadro chiaro che leghi la capacità degli inibitori di interrompere la dimerizzazione di Mpro con la perdita di attività catalitica, evidenziando così il possibile ruolo degli effetti allosterici per la regolazione della funzionalità di Mpro.

Recombinant protein for diagnostic purposes: expression optimization, purification and structural characterization.

SAVINI, LUCREZIA
2021

Abstract

Negli ultimi anni la produzione di proteine ​​ricombinanti è diventata uno strumento fondamentale per studi strutturali e biofisici ma anche per applicazioni terapeutiche e biotecnologiche. Per questo motivo sono necessari studi e approcci innovativi per l'ottimizzazione dell'espressione, purificazione e caratterizzazione di queste proteine. In particolare, il lavoro documentato in questa tesi si concentra sull'ottimizzazione della produzione del recettore dell'emoglobina umana (aka CD163) e della proteasi principale SARS-CoV-2 (aka Mpro). Il recettore dell'emoglobina umana, noto anche come CD163, è un recettore endocitico multifunzionale ed è caratterizzato da una ripetizione del recettore scavenger ricco di cisteina (SRCR). È noto per svolgere un ruolo critico in vari percorsi fisiologici e patologici. Tuttavia, i dettagli strutturali e funzionali di questa proteina non sono stati ancora chiariti, ancor meno se presi nel complesso meccanismo di interazione con il suo ligando (complesso Hb-Hp). In questo studio, CD163 è stato prodotto in modo ricombinante in due diversi sistemi di espressione eucariotica: cellule di mammiferi e cellule di insetti. Il CD163 ricombinante prodotto in entrambi i sistemi di espressione utilizzati, risulta omogeneo dopo purificazione sia mediante cromatografia di affinità metallica che per esclusione dimensionale. Il sistema Baculovirus, invece, sembra consentire una maggiore resa di espressione proteica: è quindi più adatto a produzioni su larga scala. Studi successivi hanno dimostrato che il legame fisiologico del CD163 ricombinante con il complesso Hp-Hb non è stabile e non è quantitativamente rilevante. Inizialmente, il complesso ligando-recettore sembra formarsi, ma le indagini effettuate con la diffusione dinamica della luce mostrano due distinte popolazioni di molecole all'interno della soluzione. Questo risultato pone le basi per approfondire ulteriormente la comprensione del meccanismo di legame tra CD163 ricombinante e il complesso hp-Hb. L'analisi calorimetrica condotta sui singoli componenti del complesso ternario non ha evidenziato problemi strutturali o di piegatura. Ulteriori analisi sono necessarie per comprendere e risolvere meglio il complesso. Inizialmente erano previsti studi di microscopia crioelettronica ma al momento non è stato ancora possibile effettuarli a causa della diffusione del nuovo coronavirus (SARS-CoV-2). L'improvviso sviluppo della pandemia di Covid 19 ha spostato il focus del lavoro di ricerca che ho svolto nell'ultimo anno sulla principale proteasi di questo coronavirus. La maturazione di SARS-CoV-2, infatti, richiede una proteasi principale (Mpro) per scindere le poliproteine ​​codificate dal virus. Nonostante una grande quantità di informazioni sperimentali già disponibili, vi è ampio disaccordo sulla costante di dissociazione di equilibrio monomero-dimero Mpro. Poiché l'unità funzionale di Mpro è un omodimero, la conoscenza dettagliata della termodinamica di questo equilibrio è un'informazione chiave per un possibile intervento terapeutico, con piccole molecole che interferiscono con la dimerizzazione essendo potenziali conduttori di farmaci antivirali ad ampio spettro. Con lo scattering di raggi X a piccolo angolo (SAXS) sono state determinate le caratteristiche strutturali dell'equilibrio monomero-dimero di SARS-CoV-2 Mpro, rivelando la corrispondente costante di dissociazione dell'equilibrio e i parametri termodinamici associati. La stessa tecnica è stata utilizzata per studiare come il processo di dissociazione di Mpro sia influenzato da piccoli inibitori selezionati attraverso il disegno combinatorio. I risultati mostrano che non è possibile fornire un quadro chiaro che leghi la capacità degli inibitori di interrompere la dimerizzazione di Mpro con la perdita di attività catalitica, evidenziando così il possibile ruolo degli effetti allosterici per la regolazione della funzionalità di Mpro.
In recent years, the production of recombinant proteins has become a basic tool for structural and biophysical studies but also for therapeutic and biotechnological applications. For this reason, innovative studies and approaches are necessary for the optimization of the expression, purification and characterization of these proteins. In particular, the work documented in this thesis focuses on the optimization of the production of the human hemoglobin receptor (aka CD163) and the SARS-CoV-2 Main protease (aka Mpro). The human hemoglobin receptor, aka CD163, is a multifunctional endocytic receptor and is characterized by a repetition of the cysteine-rich scavenger receptor (SRCR). It is known to play a critical role in various physiological and pathological pathways. However, the structural and functional details of this protein have not yet been elucidated, even less so if taken into the complex mechanism of interaction with its ligand (Hb-Hp complex). In this study, CD163 was recombinantly produced in two different eukaryotic expression systems: Mammalian cells and Insect cells. The recombinant CD163 produced in both expression systems used, is homogeneous after purification both by metal affinity chromatography and by size exclusion. The Baculovirus system, however, seems to allow a higher protein expression yield: it is therefore more suitable for large-scale production. Subsequent studies have shown that the physiological link of recombinant CD163 with the Hp-Hb complex is not stable and is not quantitatively relevant. Initially, the ligand-receptor complex seems to form, but the investigations carried out with dynamic light scattering show two distinct populations of molecules within the solution. This result lays the foundation for further deepening the understanding of the binding mechanism between recombinant CD163 and the hp-Hb complex. The calorimetric analysis conducted on the individual components of the ternary complex did not reveal any structural or folding problems. Further analyzes are necessary in order to better understand and solve the complex. Cryoelectronic microscopy studies were initially planned but at the moment it has not yet been possible to carry out them due to the spread of the new coronavirus (SARS-CoV-2). The sudden development of the Covid 19 pandemic has shifted the focus of the research work I have done in the last year on the main protease of this coronavirus. The maturation of SARS-CoV-2, in fact, requires a main protease (Mpro) to cleave the polyproteins encoded by the virus. Despite a large amount of experimental information already available, there is wide disagreement on the equilibrium monomer-dimer dissociation constant Mpro. Since the functional unit of Mpro is a homodimer, detailed knowledge of the thermodynamics of this equilibrium is key information for a possible therapeutic intervention, with small molecules interfering with dimerization being potential conductors of broad spectrum antiviral drugs. With small angle X-ray scattering (SAXS) the structural characteristics of the monomer-dimer equilibrium of SARS-CoV-2 Mpro were determined, revealing the corresponding equilibrium dissociation constant and associated thermodynamic parameters. The same technique was used to study how the dissociation process of Mpro is influenced by small inhibitors selected through combinatorial design. The results show that it is not possible to provide a clear picture linking the ability of inhibitors to interrupt the dimerization of Mpro with the loss of catalytic activity, thus highlighting the possible role of allosteric effects for the regulation of Mpro functionality.
recombinant protein; mpro; cd163; expression
espressione; purificazione; mpro; cd163;
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Utilizza questo identificativo per citare o creare un link a questo documento: https://hdl.handle.net/11566/291051
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