Objectives: To investigate the occurrence, the genetic environments and the transferability of oxazolidinone resistance genes in enterococci of swine origin. Materials and Methods: A total of 255 faecal samples were collected from 76 pig farms of Marche region. Selected florfenicol-resistant enterococci were screened for optrA, cfr, and poxtA genes by PCR. Isolates with at least one linezolid resistance determinant were tested for their susceptibility. Resistance genes transfer (filter mating), localization (S1-PFGE/hybridization), genetic contexts and clonality (WGS) were analyzed. Results: One hundred forty-five florfenicol-resistant enterococci were isolated from swine fecal samples. Thirty florfenicol-resistant enterococci from 23 farms had at least one linezolid resistance gene. optrA was found to be the most widespread linezolid resistance gene (24/31), while cfr and poxtA were detected in 6/31 and 7/31 enterococcal isolates, respectively. WGS analysis also showed the presence of the cfr(D) gene in Enterococcus faecalis (n = 2 isolates) and in Enterococcus avium (n = 1 isolate). The linezolid resistance genes hybridized both on chromosome and plasmids ranging from ~25 to ~240 kb. Twelve isolates were able to transfer linezolid resistance genes to enterococci recipients. WGS analysis showed a great variability of optrA genetic contexts identical or related with transposons (Tn6628 and Tn6674), plasmids (pE035 and pWo27-9) and chromosomal regions. cfr genetic environments showed identities with Tn6644-like transposon and a region from p12-2300 plasmid; cfr(D) genetic contexts were related to the corresponding region of the plasmid 4 of Enterococcus faecium E8014; poxtA was always found on Tn6657 transposon. Circular forms were obtained only for optrA- and poxtA-carrying genetic contexts. Clonality analysis revealed the presence of clones of E. faecalis (ST16, ST27, ST476, and ST585) and E. faecium (ST21) previously isolated from humans. Conclusions: These results demonstrate a dissemination of linezolid resistance genes in enterococci of swine origin in Central Italy and confirm the spread of linezolid resistance in animal settings

Obiettivi: Studiare la presenza, i contesti genetici e la trasferibilità dei geni di resistenza agli oxazolidinoni in enterococchi di origine suina. Materiali e Metodi: Sono stati raccolti 255 campioni fecali da 76 allevamenti di suini della regione Marche. Tutti gli enterococchi resistenti al florfenicolo sono stati analizzati, mediante PCR, per la presenza dei geni optrA, cfr e poxtA. Gli isolati con almeno un determinante di resistenza al linezolid sono stati saggiati mediante test di sensibilità (MIC e E-test). E’ stato inoltre studiato: (i) il trasferimento dei geni di oxazolidinone-resistenza mediante saggi di coniugazione su filtro; (ii) la localizzazione dei determinanti di resistenza tramite S1-PFGE, Southern blotting ed esperimenti di ibridazione utilizzando sonde specifiche; (iii) i contesti genetici e la clonalità mediante analisi genomica dei ceppi [Whole Genome Sequencing (WGS)]. Risultati: Nello studio sono stati isolati 145 enterococchi resistenti al florfenicolo da campioni fecali di suini. Trenta enterococchi resistenti al florfenicolo, provenienti da 23 allevamenti, avevano almeno un gene di resistenza al linezolid. optrA è risultato essere il gene di resistenza al linezolid più diffuso (23/30 ceppi), mentre cfr e poxtA sono stati rilevati rispettivamente in 6/30 e 7/30 isolati enterococcici. L'analisi WGS ha anche mostrato la presenza del gene cfr(D) in Enterococcus faecalis (n=2 isolati) e in Enterococcus avium (n=1 isolato). Saggi di ibridazione hanno mostrato che i geni di resistenza al linezolid erano localizzati sia sul cromosoma che su plasmidi di diverse dimensioni (range ~ 25 - ~ 240 kb). Dodici isolati erano in grado di trasferire geni di resistenza al linezolid ai ceppi riceventi E. faecalis JH2-2 e/o E. faecium 64/3. L'analisi WGS ha evidenziato una ampia variabilità dei contesti genetici optrA identici o correlati a trasposoni (Tn6628 e Tn6674), plasmidi (pE035 e pWo27-9) e regioni cromosomiche. Gli ambienti genetici di cfr mostravano alti livelli di identità nucleotidica sia con il trasposone Tn6644 che con una regione dal plasmide p12-2300; i contesti genetici del gene cfr(D) erano correlati alla regione corrispondente del plasmide 4 di E. faecium E8014; il gene poxtA era sempre localizzato sul trasposone Tn6657. Le forme circolari sono state ottenute solo per i contesti genetici di optrA e poxtA. Le analisi delle relazioni filogenetiche hanno rivelato la presenza di cloni di E. faecalis (ST16, ST27, ST476 e ST585) ed E. faecium (ST21) di origine umana. Conclusione: I risultati di questo studio evidenziano un’ampia distribuzione dei geni di oxazolidinone-resistenza negli enterococchi di origine suina nell'Italia centrale e confermano la diffusione della resistenza al linezolid negli ambienti animali.

Identificazione di geni di oxazolidinone resistenza e caratterizzazione degli ambienti genetici in enterococchi di origine suina isolati in allevamenti della regione marche

FIORITI, SIMONA
2021-07-27

Abstract

Obiettivi: Studiare la presenza, i contesti genetici e la trasferibilità dei geni di resistenza agli oxazolidinoni in enterococchi di origine suina. Materiali e Metodi: Sono stati raccolti 255 campioni fecali da 76 allevamenti di suini della regione Marche. Tutti gli enterococchi resistenti al florfenicolo sono stati analizzati, mediante PCR, per la presenza dei geni optrA, cfr e poxtA. Gli isolati con almeno un determinante di resistenza al linezolid sono stati saggiati mediante test di sensibilità (MIC e E-test). E’ stato inoltre studiato: (i) il trasferimento dei geni di oxazolidinone-resistenza mediante saggi di coniugazione su filtro; (ii) la localizzazione dei determinanti di resistenza tramite S1-PFGE, Southern blotting ed esperimenti di ibridazione utilizzando sonde specifiche; (iii) i contesti genetici e la clonalità mediante analisi genomica dei ceppi [Whole Genome Sequencing (WGS)]. Risultati: Nello studio sono stati isolati 145 enterococchi resistenti al florfenicolo da campioni fecali di suini. Trenta enterococchi resistenti al florfenicolo, provenienti da 23 allevamenti, avevano almeno un gene di resistenza al linezolid. optrA è risultato essere il gene di resistenza al linezolid più diffuso (23/30 ceppi), mentre cfr e poxtA sono stati rilevati rispettivamente in 6/30 e 7/30 isolati enterococcici. L'analisi WGS ha anche mostrato la presenza del gene cfr(D) in Enterococcus faecalis (n=2 isolati) e in Enterococcus avium (n=1 isolato). Saggi di ibridazione hanno mostrato che i geni di resistenza al linezolid erano localizzati sia sul cromosoma che su plasmidi di diverse dimensioni (range ~ 25 - ~ 240 kb). Dodici isolati erano in grado di trasferire geni di resistenza al linezolid ai ceppi riceventi E. faecalis JH2-2 e/o E. faecium 64/3. L'analisi WGS ha evidenziato una ampia variabilità dei contesti genetici optrA identici o correlati a trasposoni (Tn6628 e Tn6674), plasmidi (pE035 e pWo27-9) e regioni cromosomiche. Gli ambienti genetici di cfr mostravano alti livelli di identità nucleotidica sia con il trasposone Tn6644 che con una regione dal plasmide p12-2300; i contesti genetici del gene cfr(D) erano correlati alla regione corrispondente del plasmide 4 di E. faecium E8014; il gene poxtA era sempre localizzato sul trasposone Tn6657. Le forme circolari sono state ottenute solo per i contesti genetici di optrA e poxtA. Le analisi delle relazioni filogenetiche hanno rivelato la presenza di cloni di E. faecalis (ST16, ST27, ST476 e ST585) ed E. faecium (ST21) di origine umana. Conclusione: I risultati di questo studio evidenziano un’ampia distribuzione dei geni di oxazolidinone-resistenza negli enterococchi di origine suina nell'Italia centrale e confermano la diffusione della resistenza al linezolid negli ambienti animali.
Objectives: To investigate the occurrence, the genetic environments and the transferability of oxazolidinone resistance genes in enterococci of swine origin. Materials and Methods: A total of 255 faecal samples were collected from 76 pig farms of Marche region. Selected florfenicol-resistant enterococci were screened for optrA, cfr, and poxtA genes by PCR. Isolates with at least one linezolid resistance determinant were tested for their susceptibility. Resistance genes transfer (filter mating), localization (S1-PFGE/hybridization), genetic contexts and clonality (WGS) were analyzed. Results: One hundred forty-five florfenicol-resistant enterococci were isolated from swine fecal samples. Thirty florfenicol-resistant enterococci from 23 farms had at least one linezolid resistance gene. optrA was found to be the most widespread linezolid resistance gene (24/31), while cfr and poxtA were detected in 6/31 and 7/31 enterococcal isolates, respectively. WGS analysis also showed the presence of the cfr(D) gene in Enterococcus faecalis (n = 2 isolates) and in Enterococcus avium (n = 1 isolate). The linezolid resistance genes hybridized both on chromosome and plasmids ranging from ~25 to ~240 kb. Twelve isolates were able to transfer linezolid resistance genes to enterococci recipients. WGS analysis showed a great variability of optrA genetic contexts identical or related with transposons (Tn6628 and Tn6674), plasmids (pE035 and pWo27-9) and chromosomal regions. cfr genetic environments showed identities with Tn6644-like transposon and a region from p12-2300 plasmid; cfr(D) genetic contexts were related to the corresponding region of the plasmid 4 of Enterococcus faecium E8014; poxtA was always found on Tn6657 transposon. Circular forms were obtained only for optrA- and poxtA-carrying genetic contexts. Clonality analysis revealed the presence of clones of E. faecalis (ST16, ST27, ST476, and ST585) and E. faecium (ST21) previously isolated from humans. Conclusions: These results demonstrate a dissemination of linezolid resistance genes in enterococci of swine origin in Central Italy and confirm the spread of linezolid resistance in animal settings
Enterococcus spp.; oxazolidinoni; resistence; cfr; cfr-likr; optrA; poxtA
Enterococco; Oxazolidinoni; resistenza; cfr; cfr-likr; optrA; poxtA
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