Downy mildew, powdery mildew, and grey mold are the phytopathological diseases primarily responsible for economic losses in grapevine culture worldwide. These are polycyclic diseases of the aerial plant system. Starting from a few primary infection centres, under favourable environmental conditions, secondary cycles can lead to exponential epidemic developments which are difficult to contain, forcing the use of numerous preventive treatments, like phytochemicals. In this context, viticulture plays a fundamental role; in fact, the 65% of all fungicides used in agriculture are applied to vineyards, compared to the 3% of agricultural area occupied in Europe. This awareness has led to a new impulse towards the research and the development of alternative strategies to chemical means of protection, like the exploitation of genetic approaches, aimed at increasing the resistance of the host. In this scenario, one of the main purposes of this thesis has been to broaden the panorama of genetic variability, through techniques already known and used in the genetic improvement programs, such as chemical mutagenesis and somaclonal variability, or through the application of RNA interference (RNAi) approaches applied to the viticultural context, by introducing new host resistances, while maintaining the varietal identity. Furthermore, the importance of in vitro morphogenesis, in terms of de novo shoot organogenesis and somatic embryogenesis, has been emphasized as essential tool for the application of biotechnological approaches to be used on different grapevine cultivars and rootstock. Several lines of research have shown that the success of in vitro plant regeneration and the competence of genetic transformation greatly depends on the genotype of the species of interest. Therefore, both in vitro regeneration and Agrobacterium-mediated transformation systems have been efficiently endorsed for the induction of a post-transcriptional gene silencing mechanism mediated by double-stranded RNA (dsRNA) molecules, by inserting RNAi-based gene constructs in grapevine (Host Induced gene silencing – HIGS), which target genes of Botrytis cinerea and Plasmopara viticola that act as virulence effectors. Parallelly, the complex system of the pathogen-host interaction can be altered in favour of the latter through the optimization of a new RNAi approach, which is based on the exogenous application on the plant surface of the same dsRNA molecules to reduce the virulence of fungal and oomycetes pathogens. The efficacy of the exogenous application of dsRNA molecules targeting genes of Botrytis cinerea has been tested and considered suitable to obstruct and prevent the disease and delay its appearance on grapevine leaves and berries.

Peronospora, oidio e muffa grigia della vite sono le principali fitopatologie responsabili delle maggiori perdite economiche nel settore della viticoltura mondiale. Essendo delle malattie policicliche della porzione aerea della pianta, in condizioni ambientali favorevoli, a partire da pochi centri di infezione, i cicli secondari possono portare ad uno sviluppo epidemico esponenziale, di difficile controllo, richiedendo l’impiego di numerosi interventi preventivi con fitofarmaci. In tale contesto, la viticoltura gioca un ruolo chiave; infatti di tutti i fungicidi impiegati in agricoltura, il 65% sono imputabili alla difesa della vite, a fronte del 3% di aree agricole in Europa adibite a vigneto. Da questa consapevolezza nasce un nuovo impulso nella ricerca e nello sviluppo di strategie alternative ai mezzi di difesa chimici, impiegando ad esempio approcci genetici volti ad incrementare la resistenza nell’ospite. In codesto scenario, uno dei principali obiettivi della tesi è stato quello di ampliare il panorama di variabilità genetica, attraverso l’applicazione di tecniche già conosciute e impiegate in programmi di miglioramento genetico, come la mutagenesi chimica e la variabilità somaclonale, o l’associazione del meccanismo di RNAi al contesto viticolo, favorendo una maggiore tolleranza nell’ospite, mantenendo inalterata l’identità varietale. Inoltre, l’importanza dei processi di morfogenesi in vitro, tra i quali organogenesi ed embriogenesi somatica, è stata enfatizzata come strumento essenziale per l’applicazione degli approcci biotecnologici su differenti cultivar e portinnesti di vite. Molteplici linee di ricerca hanno dimostrato come il successo della rigenerazione in vitro delle piante e la competenza alla trasformazione genetica, dipendano ampiamente dal genotipo selezionato della specie di interesse. Pertanto, la rigenerazione in vitro associata alla trasformazione mediata da Agrobatterio, sono state efficientemente combinate per l’induzione del silenziamento genico post-trascrizionale, mediato da molecole di RNA a doppio filamento (dsRNA), attraverso l’introduzione di un costrutto genico RNAi in vite (Host Induced gene silencing – HIGS), mirato al silenziamento di geni target di Botrytis cinerea e Plasmopara viticola che codificano per effettori di virulenza. Parallelamente, il sistema complesso dell’interazione ospite-patogeno può essere alterato in favore dell’ospite, attraverso l’ottimizzazione di un nuovo approccio RNAi che si basa sull’applicazione esogena delle medesime molecole di RNA a doppio filamento sulla superficie delle piante, per limitare la virulenza dei patogeni fungini e oomiceti. L’efficacia di tale sistema esogeno è stata testata impiegando come target due geni di Botrytis cinerea, ed è risultata efficace per ostacolare e prevenire la muffa grigia, ritardando la sua aggressività su acini e foglie di vite.

Development of in vitro mutagenesis and gene silencing protocols in vitis spp. to promote resistance against fungal and oomycete pathogens

CAPRIOTTI, LUCA
2021

Abstract

Peronospora, oidio e muffa grigia della vite sono le principali fitopatologie responsabili delle maggiori perdite economiche nel settore della viticoltura mondiale. Essendo delle malattie policicliche della porzione aerea della pianta, in condizioni ambientali favorevoli, a partire da pochi centri di infezione, i cicli secondari possono portare ad uno sviluppo epidemico esponenziale, di difficile controllo, richiedendo l’impiego di numerosi interventi preventivi con fitofarmaci. In tale contesto, la viticoltura gioca un ruolo chiave; infatti di tutti i fungicidi impiegati in agricoltura, il 65% sono imputabili alla difesa della vite, a fronte del 3% di aree agricole in Europa adibite a vigneto. Da questa consapevolezza nasce un nuovo impulso nella ricerca e nello sviluppo di strategie alternative ai mezzi di difesa chimici, impiegando ad esempio approcci genetici volti ad incrementare la resistenza nell’ospite. In codesto scenario, uno dei principali obiettivi della tesi è stato quello di ampliare il panorama di variabilità genetica, attraverso l’applicazione di tecniche già conosciute e impiegate in programmi di miglioramento genetico, come la mutagenesi chimica e la variabilità somaclonale, o l’associazione del meccanismo di RNAi al contesto viticolo, favorendo una maggiore tolleranza nell’ospite, mantenendo inalterata l’identità varietale. Inoltre, l’importanza dei processi di morfogenesi in vitro, tra i quali organogenesi ed embriogenesi somatica, è stata enfatizzata come strumento essenziale per l’applicazione degli approcci biotecnologici su differenti cultivar e portinnesti di vite. Molteplici linee di ricerca hanno dimostrato come il successo della rigenerazione in vitro delle piante e la competenza alla trasformazione genetica, dipendano ampiamente dal genotipo selezionato della specie di interesse. Pertanto, la rigenerazione in vitro associata alla trasformazione mediata da Agrobatterio, sono state efficientemente combinate per l’induzione del silenziamento genico post-trascrizionale, mediato da molecole di RNA a doppio filamento (dsRNA), attraverso l’introduzione di un costrutto genico RNAi in vite (Host Induced gene silencing – HIGS), mirato al silenziamento di geni target di Botrytis cinerea e Plasmopara viticola che codificano per effettori di virulenza. Parallelamente, il sistema complesso dell’interazione ospite-patogeno può essere alterato in favore dell’ospite, attraverso l’ottimizzazione di un nuovo approccio RNAi che si basa sull’applicazione esogena delle medesime molecole di RNA a doppio filamento sulla superficie delle piante, per limitare la virulenza dei patogeni fungini e oomiceti. L’efficacia di tale sistema esogeno è stata testata impiegando come target due geni di Botrytis cinerea, ed è risultata efficace per ostacolare e prevenire la muffa grigia, ritardando la sua aggressività su acini e foglie di vite.
Downy mildew, powdery mildew, and grey mold are the phytopathological diseases primarily responsible for economic losses in grapevine culture worldwide. These are polycyclic diseases of the aerial plant system. Starting from a few primary infection centres, under favourable environmental conditions, secondary cycles can lead to exponential epidemic developments which are difficult to contain, forcing the use of numerous preventive treatments, like phytochemicals. In this context, viticulture plays a fundamental role; in fact, the 65% of all fungicides used in agriculture are applied to vineyards, compared to the 3% of agricultural area occupied in Europe. This awareness has led to a new impulse towards the research and the development of alternative strategies to chemical means of protection, like the exploitation of genetic approaches, aimed at increasing the resistance of the host. In this scenario, one of the main purposes of this thesis has been to broaden the panorama of genetic variability, through techniques already known and used in the genetic improvement programs, such as chemical mutagenesis and somaclonal variability, or through the application of RNA interference (RNAi) approaches applied to the viticultural context, by introducing new host resistances, while maintaining the varietal identity. Furthermore, the importance of in vitro morphogenesis, in terms of de novo shoot organogenesis and somatic embryogenesis, has been emphasized as essential tool for the application of biotechnological approaches to be used on different grapevine cultivars and rootstock. Several lines of research have shown that the success of in vitro plant regeneration and the competence of genetic transformation greatly depends on the genotype of the species of interest. Therefore, both in vitro regeneration and Agrobacterium-mediated transformation systems have been efficiently endorsed for the induction of a post-transcriptional gene silencing mechanism mediated by double-stranded RNA (dsRNA) molecules, by inserting RNAi-based gene constructs in grapevine (Host Induced gene silencing – HIGS), which target genes of Botrytis cinerea and Plasmopara viticola that act as virulence effectors. Parallelly, the complex system of the pathogen-host interaction can be altered in favour of the latter through the optimization of a new RNAi approach, which is based on the exogenous application on the plant surface of the same dsRNA molecules to reduce the virulence of fungal and oomycetes pathogens. The efficacy of the exogenous application of dsRNA molecules targeting genes of Botrytis cinerea has been tested and considered suitable to obstruct and prevent the disease and delay its appearance on grapevine leaves and berries.
Grapevine; gene silencing; mutagenesis; fungal pathogen.
vite; silenziamento genetico; mutagenesi; fungo patogeno
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Descrizione: Tesi_Capriotti
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Utilizza questo identificativo per citare o creare un link a questo documento: https://hdl.handle.net/11566/290838
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