The increase of the antibiotic resistance is one of the most alarming health care problems and tends to become a threatening emergency in the next future. Tolerant and persistent bacterial cells largely contribute to this alarming scenario, since, thanks to a transient modification of genes expression, they can tolerate heavy antibiotic pressure without the need to acquire resistance genetic determinants. Efflux pumps (EP) are main antibiotic resistance mechanisms in both Gram-negatives and Gram-positives by extruding from the cell different toxic compounds, including antibiotics. Moreover, recent findings unraveled their role in different bacterial functions as inter-cellular communication, biofilm development, virulence and persistence. The use of efflux pump inhibitors (EPIs) in combination with known antibiotics seems a promising strategy to counteract multidrug-resistant (MDR) infections. This PhD project aimed to validate novel EPIs against MexXY-OprM and NorA of respectively Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus, two of the most difficult to treat nosocomial pathogens. The results showed that the natural alkaloid berberine can bind to the MexY inner channel of the aminoglycoside-extruding pump MexXY-OprM lowering, at the concentration of 80 µg/ml, both tobramycin MIC (at least four-folds) and persisters amount (between 10 and 1000 times) of 23 lab and clinical P. aeruginosa strains, without affecting the mexY deleted strain K1525; moreover, killing curves assays highlighted an up to 3 log enhanced bacterial killing of tobramycin in association with berberine, which did not show any hemolytic activity at the active concentrations. Three quinoline-based compounds (3a, 3b and 37a) were selected and characterized as S. aureus NorA EPIs, according to their ability to reduce (>60%) the efflux of ethidium bromide; their synergistic (four-fold MIC reduction) activity at very low concentrations (6.25 and 3.13 µg/ml) with ciprofloxacin was demonstrated against the norA-overexpressing strain SA199B. All active quinoline derivatives showed no toxic effects at the synergistic concentrations by hemolysis and human cell (THP-1 and A549) toxicity tests. In conclusion, novel efflux pump inhibitors were identified, able to rescue tobramycin and ciprofloxacin susceptibility of both P. aeruginosa and S aureus; these new molecules could represent i) promising adjuvants to be used in drugs associations and ii) new lead structures to be further optimized to find new strategies to counteract difficult to treat bacterial infections.

Il costante aumento del fenomeno dell’ antibiotico resistenza è attualmente uno dei più preoccupanti problemi di salute pubblica e rischia di costituire una vera emergenza nel prossimo futuro. A complicare ulteriormente il quadro, le forme batteriche antibiotico tolleranti e persistenti sono in grado di sopravvivere a elevate dosi di antibiotico senza tuttavia portare specifici determinanti di resistenza. Si tratta di forme transienti, capaci di sopravvivere in condizioni sfavorevoli grazie a modifiche temporanee dell’espressione genica. Tra tutti i meccanismi di resistenza agli antibiotici, le pompe di efflusso sono tra i più comuni nei patogeni sia Gram-positivi che Gram-negativi; tali complessi proteici sono in grado di espellere molecole tossiche, compresi gli antibiotici, evitando quindi un loro accumulo all’interno del citoplasma. Inoltre, recenti studi hanno dimostrato un importante coinvolgimento delle pompe di efflusso anche in altri processi fisiologici batterici come la comunicazione intercellulare, la formazione di biofilm, la regolazione della virulenza e la formazione di cellule persistenti. Un sempre maggior interesse si sta concentrando sull’uso di Inibitori delle Pompe di Efflusso (EPIs) in combinazione con antimicrobici già in uso, come strategia per contrastare le infezioni resistenti agli antibiotici; ad oggi tuttavia nessuna di queste molecole è attualmente utilizzata in clinica a causa della intrinseca elevata tossicità. Questo progetto di dottorato ha avuto come obiettivo la validazione di nuovi inibitori delle pompe di efflusso MexXY-OprM di Pseudomonas aeruginosa e NorA di Staphylococcus aureus, due tra i patogeni più resilienti al trattamento antibiotico. L’alcaloide naturale berberina legandosi alla pompa di efflusso MexXY-OprM, principale responsabile dell’efflusso degli aminoglicosidi, si è rivelato in grado di potenziare (di 2-3 log) l’attività battericida della tobramicina e di ridurre sia la resistenza (di almeno 4 volte) che la persistenza (di 10-1000 volte) al farmaco in 23 ceppi sia di laboratorio che clinici alla concentrazione di 80 µg/ml, senza mostrare alcun effetto sul ceppo di laboratorio K1525 (ΔmexY) e senza mostrare attività emolitica alle concentrazioni usate. Tre composti (3a, 3b e 37a) basati su un nucleo chinolinico sono stati caratterizzati per la loro capacità di inibire l’efflusso della ciprofloxacina tramite NorA in S. aureus dimostrando una capacità di inibizione > 60%. Questi composti si sono rivelati inoltre sinergici con la ciprofloxacina, riducendone la MIC di almeno 4-volte nei confronti del ceppo SA1199B (over-esprimente norA) già a basse concentrazioni (6.25 e 3.13 µg/ml). Le concentrazioni sinergiche di questi composti non hanno mostrato né attività emolitica né attività citotossica nei confronti delle linee cellulari THP-1 e A549. In conclusione, in questo lavoro sono stati identificati nuovi EPIs in grado di contrastare la resilienza agli antibiotici sia in P. aeruginosa che S. aureus: queste molecole, risultate promettenti per la loro attività sinergica in combinazione con gli antibiotici e la loro mancanza di tossicità, possono costituire un ottimo punto di partenza per lo sviluppo di molecole ottimizzate in termini di affinità con le loro strutture bersaglio e di sinergia con l’antibiotico nella prospettiva di un loro utilizzo nella pratica clinica contro infezioni difficili da trattare sostenute da ceppi MDR/XDR/PDR di P. aeruginosa e S. aureus.

Validation of novel inhibitors of mexxy-oprm and nora efflux pumps to counteract the antibiotic resilience of p. aeruginosa and s. aureus

CEDRARO, NICHOLAS
2021-05-28

Abstract

Il costante aumento del fenomeno dell’ antibiotico resistenza è attualmente uno dei più preoccupanti problemi di salute pubblica e rischia di costituire una vera emergenza nel prossimo futuro. A complicare ulteriormente il quadro, le forme batteriche antibiotico tolleranti e persistenti sono in grado di sopravvivere a elevate dosi di antibiotico senza tuttavia portare specifici determinanti di resistenza. Si tratta di forme transienti, capaci di sopravvivere in condizioni sfavorevoli grazie a modifiche temporanee dell’espressione genica. Tra tutti i meccanismi di resistenza agli antibiotici, le pompe di efflusso sono tra i più comuni nei patogeni sia Gram-positivi che Gram-negativi; tali complessi proteici sono in grado di espellere molecole tossiche, compresi gli antibiotici, evitando quindi un loro accumulo all’interno del citoplasma. Inoltre, recenti studi hanno dimostrato un importante coinvolgimento delle pompe di efflusso anche in altri processi fisiologici batterici come la comunicazione intercellulare, la formazione di biofilm, la regolazione della virulenza e la formazione di cellule persistenti. Un sempre maggior interesse si sta concentrando sull’uso di Inibitori delle Pompe di Efflusso (EPIs) in combinazione con antimicrobici già in uso, come strategia per contrastare le infezioni resistenti agli antibiotici; ad oggi tuttavia nessuna di queste molecole è attualmente utilizzata in clinica a causa della intrinseca elevata tossicità. Questo progetto di dottorato ha avuto come obiettivo la validazione di nuovi inibitori delle pompe di efflusso MexXY-OprM di Pseudomonas aeruginosa e NorA di Staphylococcus aureus, due tra i patogeni più resilienti al trattamento antibiotico. L’alcaloide naturale berberina legandosi alla pompa di efflusso MexXY-OprM, principale responsabile dell’efflusso degli aminoglicosidi, si è rivelato in grado di potenziare (di 2-3 log) l’attività battericida della tobramicina e di ridurre sia la resistenza (di almeno 4 volte) che la persistenza (di 10-1000 volte) al farmaco in 23 ceppi sia di laboratorio che clinici alla concentrazione di 80 µg/ml, senza mostrare alcun effetto sul ceppo di laboratorio K1525 (ΔmexY) e senza mostrare attività emolitica alle concentrazioni usate. Tre composti (3a, 3b e 37a) basati su un nucleo chinolinico sono stati caratterizzati per la loro capacità di inibire l’efflusso della ciprofloxacina tramite NorA in S. aureus dimostrando una capacità di inibizione > 60%. Questi composti si sono rivelati inoltre sinergici con la ciprofloxacina, riducendone la MIC di almeno 4-volte nei confronti del ceppo SA1199B (over-esprimente norA) già a basse concentrazioni (6.25 e 3.13 µg/ml). Le concentrazioni sinergiche di questi composti non hanno mostrato né attività emolitica né attività citotossica nei confronti delle linee cellulari THP-1 e A549. In conclusione, in questo lavoro sono stati identificati nuovi EPIs in grado di contrastare la resilienza agli antibiotici sia in P. aeruginosa che S. aureus: queste molecole, risultate promettenti per la loro attività sinergica in combinazione con gli antibiotici e la loro mancanza di tossicità, possono costituire un ottimo punto di partenza per lo sviluppo di molecole ottimizzate in termini di affinità con le loro strutture bersaglio e di sinergia con l’antibiotico nella prospettiva di un loro utilizzo nella pratica clinica contro infezioni difficili da trattare sostenute da ceppi MDR/XDR/PDR di P. aeruginosa e S. aureus.
The increase of the antibiotic resistance is one of the most alarming health care problems and tends to become a threatening emergency in the next future. Tolerant and persistent bacterial cells largely contribute to this alarming scenario, since, thanks to a transient modification of genes expression, they can tolerate heavy antibiotic pressure without the need to acquire resistance genetic determinants. Efflux pumps (EP) are main antibiotic resistance mechanisms in both Gram-negatives and Gram-positives by extruding from the cell different toxic compounds, including antibiotics. Moreover, recent findings unraveled their role in different bacterial functions as inter-cellular communication, biofilm development, virulence and persistence. The use of efflux pump inhibitors (EPIs) in combination with known antibiotics seems a promising strategy to counteract multidrug-resistant (MDR) infections. This PhD project aimed to validate novel EPIs against MexXY-OprM and NorA of respectively Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus, two of the most difficult to treat nosocomial pathogens. The results showed that the natural alkaloid berberine can bind to the MexY inner channel of the aminoglycoside-extruding pump MexXY-OprM lowering, at the concentration of 80 µg/ml, both tobramycin MIC (at least four-folds) and persisters amount (between 10 and 1000 times) of 23 lab and clinical P. aeruginosa strains, without affecting the mexY deleted strain K1525; moreover, killing curves assays highlighted an up to 3 log enhanced bacterial killing of tobramycin in association with berberine, which did not show any hemolytic activity at the active concentrations. Three quinoline-based compounds (3a, 3b and 37a) were selected and characterized as S. aureus NorA EPIs, according to their ability to reduce (>60%) the efflux of ethidium bromide; their synergistic (four-fold MIC reduction) activity at very low concentrations (6.25 and 3.13 µg/ml) with ciprofloxacin was demonstrated against the norA-overexpressing strain SA199B. All active quinoline derivatives showed no toxic effects at the synergistic concentrations by hemolysis and human cell (THP-1 and A549) toxicity tests. In conclusion, novel efflux pump inhibitors were identified, able to rescue tobramycin and ciprofloxacin susceptibility of both P. aeruginosa and S aureus; these new molecules could represent i) promising adjuvants to be used in drugs associations and ii) new lead structures to be further optimized to find new strategies to counteract difficult to treat bacterial infections.
antibiotic resistance; efflux pumps; inhibitors
resistenza agli antibiotici; inibitori
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Tipologia: Tesi di dottorato
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