Effect of manuka honey on 5-fluorouracil chemosensitivity in colonspheres enriched with cancer stem (-like) cells

The main objective of the present work was to evaluate the in vitro effect of Manuka honey and its combination with 5-Fu on cancer stem-like cells deriving from HCT-116 colon adenocarcinoma cell line, enriched through the sphere formation assay, which also made possible to work with a 3D tumor model that better mimics what really happens in vivo. In this study, it was observed that Manuka honey has high total antioxidant activity and is an excellent source of phenolic compounds, which have been identified and quantified. It was subsequently observed that Manuka honey alone and more in combination with 5-Fu was able to decrease some morphological and physical parameters of colonspheres enriched with cancer stem cells closely correlated with the pharmacological efficacy in 3D models, such as the volume of the entire culture, the diameter, solidity, sphericity, mass density and weight of the spheroids without exerting, at the same time, any cytotoxic effect on healthy colon cells. Specifically, the treatment of colonspheres with Manuka honey and its combination with 5-Fu led to an increase in intracellular ROS levels, associated with a reduction in expression of the CD44 surface marker and reduced glutathione levels and an increased number of apoptotic cells, mainly due to a strong downregulation of various apoptosis inhibitors, including IAPs, IGFs and HSPs. A direct effect of Manuka honey on the chemosensitivity of stem cells to 5-Fu was also observed, with a clear reduction in the levels of ABCG2, one of the membrane transporters responsible for the extrusion of chemotherapeutic agents from the inside to the outside of the cells. Another direct effect was on thymidylate synthase, one of the 5-Fu targets: the combined treatment additionally decreased the levels of this enzyme that allows the synthesis of DNA ex novo compared to the 5-Fu alone. Manuka honey, especially in combination with 5-Fu, was also able to inhibit one of the fundamental characteristics of cancer stem cells: the capacity of self-renewal, which is essentially controlled by three different pathways: Wnt/β-catenin, Hedgehog and Notch. Manuka honey and its combination with chemotherapeutic agent were able to modulate the gene expression of some key elements of these pathways and therefore of their target genes: Manuka honey, especially in combination with 5-Fu, was able to significantly reduce the migration capacity of these cells, closely related with the epithelial-mesenchymal transition process and therefore with metastasis; this reduced migratory capacity was correlated with a clear reduction, in cancer stem-like cells treated with Manuka honey and 5-Fu, of the gene expression levels of some transcription factors, such as Slug, Snail and Twist associated with an increase in E-cadherin protein levels, the adhesion protein associated with the epithelial phenotype. The combined treatment also significantly regulated the levels of some pro-angiogenic factors, some of which were instead up-regulated by treatment with 5-Fu alone. Finally, it was observed that Manuka honey in combination with chemotherapeutic agent was able to influence the length of telomeres, which were shorter than untreated cells. These results indicate that Manuka honey has an in vitro chemosensitizing effect against 5-Fu on colon cancer stem-like cells; these interesting findings, although preliminary, suggest a potential synergistic action of honey with 5-Fu, which could be useful in deepening the studies on natural compounds to be used in association with conventional medical therapies as already happens with folinic acid (leucovorin), which, in addition to increase the effectiveness of 5-Fu, also decreases its side effects.

L'obiettivo principale del presente lavoro è stato quello di valutare in vitro l’effetto del miele di Manuka e della sua combinazione con il 5-Fu sulle cellule simil-staminali del cancro derivanti dalla linea cellulare di adenocarcinoma del colon HCT-116, arricchite attraverso il saggio di formazione di sfere, che ha permesso inoltre di lavorare con un modello tumorale 3D che meglio mima ciò che accade in vivo. In questo studio è stato osservato che il miele di Manuka ha un’elevata capacità antiossidante ed è un’ottima fonte di composti fenolici. È stato successivamente osservato che il miele di Manuka da solo ed in maniera maggiore in combinazione con il 5-Fu è stato in grado di diminuire parametri morfologici e fisici delle colonsfere, strettamente correlati con l’efficacia farmacologica nei modelli 3D: il volume dell’intera coltura, il diametro, la solidità, la sfericità, la densità di massa ed il peso degli sferoidi senza mostrare, al tempo stesso, alcun effetto citotossico in cellule sane del colon. Nello specifico, il trattamento delle colonsfere con il miele di Manuka e la sua combinazione con il 5-Fu ha portato ad un aumento nei livelli intracellulari di ROS, associato ad una riduzione dell’espressione del marker di superficie CD44 e dei livelli di GSH ed un aumentato numero di cellule apoptotiche, dovuto ad una forte downregolazione di diversi inibitori dell’apoptosi, tra cui le IAPs, le IGFs e le HSPs. È stato inoltre notato un effetto diretto del miele di Manuka sulla chemiosensibilità delle cellule staminali al 5-Fu con una netta riduzione nei livelli di ABCG2, uno dei trasportatori di membrana responsabili dell’estrusione dei chemioterapici dall’interno all’esterno della cellula. Un altro effetto diretto è quello osservato su uno dei target del 5-Fu, la timidilato sintasi: il trattamento combinatorio ha diminuito maggiormente i livelli di questo enzima che permette la sintesi di DNA ex-novo rispetto al solo chemioterapico. Il miele di Manuka, soprattutto in combinazione con il 5-Fu è stato in grado di inibire una delle caratteristiche fondamentali delle cellule staminali del cancro: la capacità di autorinnovamento, controllata da tre differenti pathways: Wnt/β-catenina, Hedgehog e Notch: il miele di Manuka e la sua combinazione con il chemioterapico hanno interagito con l’espressione genica di alcuni elementi chiave di questi pathways e quindi dei loro geni target. È stato osservato inoltre che il miele di Manuka, soprattutto in combinazione con il chemioterapico, ha ridotto in maniera significativa la capacità di migrazione di queste cellule, associata alla capacità di metastatizzazione. È stata osservata una netta riduzione nelle cellulle simil-staminali tumorali trattate con miele di Manuka e chemioterapico dei livelli di espressione genica di alcuni fattori di trascrizione, come Slug, Snail e Twist associata ad un aumento dei livelli proteici dell’E-caderina, la proteina di adesione associata al fenotipo epiteliale. Il trattamento combinatorio ha notevolmente regolato anche i livelli di alcuni fattori pro-angiogenici, alcuni dei quali sono risultati invece up-regolati dal trattamento con il solo 5-Fu. Infine è risultato che il miele di Manuka in combinazione con il chemioterapico è stato in grado di influenzare la lunghezza dei telomeri, che risultano essere più corti rispetto alle cellule non trattate. Questi risultati indicano che il miele di Manuka ha un effetto chemiosensibilizzante in vitro nei confronti del 5-Fu sulle cellule simil-staminali del colon; queste interessanti scoperte, sebbene preliminari, suggeriscono una potenziale azione sinergica del miele con il 5-Fu, che potrebbe risultare utile nell’approfondire gli studi su composti naturali da utilizzare in concomitanza con le terapie mediche convenzionali come accade già con l’acido folinico (leucovorin), che oltre ad aumentare l’efficacia del 5-Fu, ne diminuisce anche gli effetti collaterali.