Background: Systemic Sclerosis (SSc) is a rare disorder of the connective tissue, characterized by fibrosis of the skin, blood vessels, and visceral organs; additional manifestations include alterations of the microvasculature and production of autoantibodies. An important step forward has been the demonstration in SSc patients but not in controls, the presence of agonistic autoantibodies targeting endogenous PDGF receptor in SSc patients. These data suggest that the anti-PDGFR autoantibodies play an active role in the pathogenesis of SSc. Our research group has developed techniques to clone anti-PDGFR monoclonal autoantibodies; identified the different PDGFR epitopes recognized by agonistic anti PDGFR autoantibody; demonstrated that they are pro fibrotic in vivo tested in the preclinical model of the transgenic mouse. Materials and methods: by a competitive ELISA, serums of SSc patients were analyzed. 25 SSc serums positive by ELISA with 25 control serums were shipped to Pepscan Presto, Lelystat, The Netherlands, and tested with a Pepscan-based ELISA. A specific peptide library was then generated to evaluate the binding between the conformational epitopes of PDGFr and the autoantibodies present in the SSc serum and identify which of these are the target of higher reactivity. In addition to the 60 peptides expression of the first three domains of the extracellular portion of PDGFr, the library also contains 60 peptides representing the NOX-2 protein belonging to the NADPH oxidase family. According to our hypothesis, both the NOX-2 protein and the PDGFr are the target of the autoimmune response in SSc patients. Results: a different reactivity of the serums of SSc patients compared to the control serums emerged against some peptides contained in the library. This shows that the serums of SSc patients contain autoantibodies that recognize specific conformational epitopes:13 belonging to NOX2 and 21 to PDGFR. Among the statistically significant peptides, we identified the peptides that are able to better discriminate patients from the controls and that could represent possible targets for epitope-based diagnostic tests in the future. Cut-off values were identified, using Roc curves. The better peptides able to discriminate SSc patients from controls are: PEP8 and PEP9 (NOX expression), PEP61 and PEP75 (PDGFr expression). The cut-off value of PEP61 equal to 435 is the one associated with the highest sensitivity and specificity (se= 68%, sp= 80%). Despite too small a sample size to statistically significant conclusions, regardless of the cut-off score considered, five individuals belonging to the control group always position themselves above the threshold level, always positive to a hypothetical diagnostic test. Conclusions: with this research work, specific conformational epitopes have been identified that represent the site of binding between anti-PDGFr antibodies with serums of SSc patients. There is a different reactivity of SSc serums to the PDGF receptor on the basis of which it has been possible to subdivide patients into sub-groups that are partly different from the traditional classification (diffuse vs limited form). Independently of the cut-off score considered, five control serums have an extremely high reactivity for all peptides in the library, with a behavior comparable to diffuse SSc patients. This data makes us question whether this serum polireactivity may be the expression of a familiarity with autoimmune diseases or a disease not yet manifest. If these observations are confirmed by studies on a larger sample number, these peptides could be the target of specific epitope-based diagnostic tests, and especially of targeted molecular therapies.

Background: La Sclerosi Sistemica (SSc) è una malattia rara del tessuto connettivo caratterizzata da danno microvascolare; attivazione dei fibroblasti con aumentata produzione di collageno nella cute, vasi sanguigni e organi interni; disregolazione dell’immunità con produzione di autoanticorpi. Importante è stata la scoperta di autoanticorpi che riconoscono e attivano il recettore del PDGF in pazienti SSc ma non nei controlli, inducendo stress ossidativo e deposizione di collagene, suggerendo un loro ruolo attivo nella patogenesi della SSc. Il nostro gruppo di ricerca ha messo a punto tecniche per clonare autoanticorpi monoclonali anti-PDGFR; identificato i diversi epitopi del PDGFR riconosciuti dai vari monoclonali; dimostrato che questi autoanticorpi causano fibrosi in vivo utilizzando un nuovo modello murino. Materiali e metodi: Utilizzando un saggio ELISA già ottimizzato, sono stati analizzati i sieri di pazienti SSc. 25 sieri SSc positivi al test ELISA insieme a 25 sieri controllo sono stati spediti a Pepscan Presto, Lelystat, Olanda, e testati con una Pepscan-based ELISA. Qui è stata generata una specifica library peptidica per valutare il legame tra gli epitopi conformazionali del PDGFr e gli autoanticorpi presenti nel siero SSc e identificare quali tra questi fossero il bersaglio di una maggiore reattività. Oltre ai 60 peptidi espressione dei primi tre domini della porzione extracellulare del PDGFr, la library contiene anche 60 peptidi rappresentanti la proteina NOX-2 appartenente alla famiglia delle NADPH ossidasi. Secondo la nostra ipotesi, sia la proteina NOX-2 che il PDGFr rappresentano il bersaglio della risposta autoimmunitaria da parte dei pazienti affetti da SSc. Risultati: esiste una differente reattività dei sieri dei pazienti SSc rispetto ai sieri controllo nei confronti di alcuni peptidi contenuti nella library. Ciò dimostra che i sieri SSc contengono autoanticorpi che riconoscono epitopi conformazionali specifici: 13 appartenenti a NOX2 e 21 al PDGFR. Tra i peptidi statisticamente significativi sono stati identificati alcuni che riescono a discriminare meglio i pazienti dai controlli e che potrebbero rappresentare i possibili bersagli di test diagnostici epitope-based. Abbiamo individuato valori di cut-off, mediante curve Roc. I peptidi migliori a discriminare i pazienti SSc dai controlli sono: PEP8 e PEP9 (espressione di NOX), PEP61 e PEP75 (espressione del PDGFr). Il valore cut-off di PEP61 = 435 è quello associato alla più alta sensibilità e specificità (se= 68%, sp= 80%). Nonostante una numerosità campionaria troppo esigua per conclusioni statisticamente significative, indipendentemente dal punteggio cut off considerato, cinque individui appartenenti al gruppo controlli si posizionino sempre al di sopra del livello soglia, risultando sempre positivi ad un ipotetico test diagnostico. Conclusioni: Con questo lavoro sono stati individuati specifici epitopi conformazionali che rappresentano il sito di legame tra anticorpi anti-PDGFr con i sieri di pazienti SSc. Esiste una diversa reattività dei sieri SSc al recettore del PDGF sulla base della quale è stato possibile fare una suddivisione dei pazienti in sottogruppi in parte diversi rispetto alla tradizionale classificazione (forma diffusa vs limitata). Indipendentemente dal punteggio cut-off considerato, cinque sieri controllo presentano una reattività estremamente elevata per tutti i peptidi della library, con un comportamento paragonabile ai pazienti SSc diffusa. Ci si interroga se questa polireattività sierica può essere espressione di una familiarità verso malattie autoimmuni o di una malattia non ancora manifesta. Se queste osservazioni verranno confermate da studi su una più ampia numerosità campionaria, questi peptidi potranno rappresentare il bersaglio di specifici test diagnostici epitope-based, e soprattutto di mirate terapie molecolari.

Nuovi biomarcatori molecolari per la diagnosi e la terapia della sclerosi sistemica / Fischetti, Colomba. - (2021 Mar 08).

Nuovi biomarcatori molecolari per la diagnosi e la terapia della sclerosi sistemica

FISCHETTI, COLOMBA
2021-03-08

Abstract

Background: Systemic Sclerosis (SSc) is a rare disorder of the connective tissue, characterized by fibrosis of the skin, blood vessels, and visceral organs; additional manifestations include alterations of the microvasculature and production of autoantibodies. An important step forward has been the demonstration in SSc patients but not in controls, the presence of agonistic autoantibodies targeting endogenous PDGF receptor in SSc patients. These data suggest that the anti-PDGFR autoantibodies play an active role in the pathogenesis of SSc. Our research group has developed techniques to clone anti-PDGFR monoclonal autoantibodies; identified the different PDGFR epitopes recognized by agonistic anti PDGFR autoantibody; demonstrated that they are pro fibrotic in vivo tested in the preclinical model of the transgenic mouse. Materials and methods: by a competitive ELISA, serums of SSc patients were analyzed. 25 SSc serums positive by ELISA with 25 control serums were shipped to Pepscan Presto, Lelystat, The Netherlands, and tested with a Pepscan-based ELISA. A specific peptide library was then generated to evaluate the binding between the conformational epitopes of PDGFr and the autoantibodies present in the SSc serum and identify which of these are the target of higher reactivity. In addition to the 60 peptides expression of the first three domains of the extracellular portion of PDGFr, the library also contains 60 peptides representing the NOX-2 protein belonging to the NADPH oxidase family. According to our hypothesis, both the NOX-2 protein and the PDGFr are the target of the autoimmune response in SSc patients. Results: a different reactivity of the serums of SSc patients compared to the control serums emerged against some peptides contained in the library. This shows that the serums of SSc patients contain autoantibodies that recognize specific conformational epitopes:13 belonging to NOX2 and 21 to PDGFR. Among the statistically significant peptides, we identified the peptides that are able to better discriminate patients from the controls and that could represent possible targets for epitope-based diagnostic tests in the future. Cut-off values were identified, using Roc curves. The better peptides able to discriminate SSc patients from controls are: PEP8 and PEP9 (NOX expression), PEP61 and PEP75 (PDGFr expression). The cut-off value of PEP61 equal to 435 is the one associated with the highest sensitivity and specificity (se= 68%, sp= 80%). Despite too small a sample size to statistically significant conclusions, regardless of the cut-off score considered, five individuals belonging to the control group always position themselves above the threshold level, always positive to a hypothetical diagnostic test. Conclusions: with this research work, specific conformational epitopes have been identified that represent the site of binding between anti-PDGFr antibodies with serums of SSc patients. There is a different reactivity of SSc serums to the PDGF receptor on the basis of which it has been possible to subdivide patients into sub-groups that are partly different from the traditional classification (diffuse vs limited form). Independently of the cut-off score considered, five control serums have an extremely high reactivity for all peptides in the library, with a behavior comparable to diffuse SSc patients. This data makes us question whether this serum polireactivity may be the expression of a familiarity with autoimmune diseases or a disease not yet manifest. If these observations are confirmed by studies on a larger sample number, these peptides could be the target of specific epitope-based diagnostic tests, and especially of targeted molecular therapies.
8-mar-2021
Background: La Sclerosi Sistemica (SSc) è una malattia rara del tessuto connettivo caratterizzata da danno microvascolare; attivazione dei fibroblasti con aumentata produzione di collageno nella cute, vasi sanguigni e organi interni; disregolazione dell’immunità con produzione di autoanticorpi. Importante è stata la scoperta di autoanticorpi che riconoscono e attivano il recettore del PDGF in pazienti SSc ma non nei controlli, inducendo stress ossidativo e deposizione di collagene, suggerendo un loro ruolo attivo nella patogenesi della SSc. Il nostro gruppo di ricerca ha messo a punto tecniche per clonare autoanticorpi monoclonali anti-PDGFR; identificato i diversi epitopi del PDGFR riconosciuti dai vari monoclonali; dimostrato che questi autoanticorpi causano fibrosi in vivo utilizzando un nuovo modello murino. Materiali e metodi: Utilizzando un saggio ELISA già ottimizzato, sono stati analizzati i sieri di pazienti SSc. 25 sieri SSc positivi al test ELISA insieme a 25 sieri controllo sono stati spediti a Pepscan Presto, Lelystat, Olanda, e testati con una Pepscan-based ELISA. Qui è stata generata una specifica library peptidica per valutare il legame tra gli epitopi conformazionali del PDGFr e gli autoanticorpi presenti nel siero SSc e identificare quali tra questi fossero il bersaglio di una maggiore reattività. Oltre ai 60 peptidi espressione dei primi tre domini della porzione extracellulare del PDGFr, la library contiene anche 60 peptidi rappresentanti la proteina NOX-2 appartenente alla famiglia delle NADPH ossidasi. Secondo la nostra ipotesi, sia la proteina NOX-2 che il PDGFr rappresentano il bersaglio della risposta autoimmunitaria da parte dei pazienti affetti da SSc. Risultati: esiste una differente reattività dei sieri dei pazienti SSc rispetto ai sieri controllo nei confronti di alcuni peptidi contenuti nella library. Ciò dimostra che i sieri SSc contengono autoanticorpi che riconoscono epitopi conformazionali specifici: 13 appartenenti a NOX2 e 21 al PDGFR. Tra i peptidi statisticamente significativi sono stati identificati alcuni che riescono a discriminare meglio i pazienti dai controlli e che potrebbero rappresentare i possibili bersagli di test diagnostici epitope-based. Abbiamo individuato valori di cut-off, mediante curve Roc. I peptidi migliori a discriminare i pazienti SSc dai controlli sono: PEP8 e PEP9 (espressione di NOX), PEP61 e PEP75 (espressione del PDGFr). Il valore cut-off di PEP61 = 435 è quello associato alla più alta sensibilità e specificità (se= 68%, sp= 80%). Nonostante una numerosità campionaria troppo esigua per conclusioni statisticamente significative, indipendentemente dal punteggio cut off considerato, cinque individui appartenenti al gruppo controlli si posizionino sempre al di sopra del livello soglia, risultando sempre positivi ad un ipotetico test diagnostico. Conclusioni: Con questo lavoro sono stati individuati specifici epitopi conformazionali che rappresentano il sito di legame tra anticorpi anti-PDGFr con i sieri di pazienti SSc. Esiste una diversa reattività dei sieri SSc al recettore del PDGF sulla base della quale è stato possibile fare una suddivisione dei pazienti in sottogruppi in parte diversi rispetto alla tradizionale classificazione (forma diffusa vs limitata). Indipendentemente dal punteggio cut-off considerato, cinque sieri controllo presentano una reattività estremamente elevata per tutti i peptidi della library, con un comportamento paragonabile ai pazienti SSc diffusa. Ci si interroga se questa polireattività sierica può essere espressione di una familiarità verso malattie autoimmuni o di una malattia non ancora manifesta. Se queste osservazioni verranno confermate da studi su una più ampia numerosità campionaria, questi peptidi potranno rappresentare il bersaglio di specifici test diagnostici epitope-based, e soprattutto di mirate terapie molecolari.
SYSTEMIC SCLEROSIS; BIOMARKERS
SCLEROSI SISTEMICA; BIOMARCATORI
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Descrizione: Tesi_Fischetti
Tipologia: Tesi di dottorato
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