Generation of human PDGFRα-transgenic mouse: a novel experimental model of skin fibrosis

ABSTRACT (Eng) Background: Platelet Derived Growth Factor (PDGF) Receptor α (PDGFRα) is a target of the autoimmune response in scleroderma (SSc). Both total serum IgG (SSc-IgG) and anti-PDGFRα antibodies cloned from memory B cells of SSc patients (SSc-Mabs) [Moroncini G. et al., A&R 2015] demonstrated the ability to increase collagen gene transcription in healthy donor skin fibroblasts and to induce fibrosis ex vivo, in skin grafts in SCID mice [Luchetti M. et al., A&R 2016]. In order to replicate these findings in vivo, we generated human PDGFRα-transgenic mice. Materials and Methods: Full length human PDGFRα cDNA was knocked-in into the ubiquitously expressed Rosa26 locus on mouse chromosome 6. Correctly targeted C57BL/6 ES cell clones were selected for blastocyst microinjection, followed by chimera production. F2 heterozygous C57BL/6-hPDGFRα transgenic mice were used to establish the colony. Twelve weeks-old male mice were injected into the back skin at days 0, 3, 6 and 9, either with 0.02 mg/ml of SSc-Mabs (VHPAM-Vκ16F4 or VHPAM-Vκ13B8), or with 2 mg/ml of SSc-IgG or IgG purified from serum of healthy donors (HD-IgG). Vehicle only injection control was included. Age- and sex- matched C57BL/6 wild type mice were used as controls. Animals were sacrificed at day 14. Human PDGFRα transgene expression and collagen amount were assessed in explanted skin tissue. To induce systemic fibrosis, osmotic minipumps containing either 200 μl PBS as vehicle or SSc-MabVHPAM-Vκ16F4 (100 μg) or SSc-MabVHPAM-Vλ16F4 (100 μg) or a combination of SSc-Mabs VHPAM-Vκ16F4 and VHPAM-Vλ16F4 (50 μg + 50 μg) were implanted for 28 days on the back skin of animals. Mice were sacrificed at day 28. Collagen amount, M2 macrophages and alpha smooth muscle (α-SMA) deposition were assessed in explanted skin and lung tissue. Results: Transgenic mice were phenotypically normal, fertile, and did not display any apparent pathological features.Human PDGFRα mRNA and protein were detectable in the skin of all examined transgenic mice. Intradermal injection of stimulatory human SSc-Mab VHPAM-Vκ16F4 or SSc-IgG resulted in dermal thickening and increased collagen deposition, whereas non-stimulatory human SSc-Mab VHPAM-Vκ13B8 or HD-IgG did not induce any significant skin tissue alterations compared to vehicle control. C57BL/6 wild type mice did not show any significant skin tissue changes with any antibodies. Subcutaneous continuous administration of SSc-MabVHPAM-Vκ16F4 or SSc-MabVHPAM-Vλ16F4 or the combination of SSc-Mabs VHPAM-Vκ16F4 and VHPAM-Vλ16F4 resulted in dermal thickening and increased collagen deposition in skin tissue. Moreover perivascular and peribronchiolar increased collagen amount were detected in lung tissue, with some inflammatory areas characterized by M2 macrophages and α-SMA endothelial positive cells in small vessels. Conclusions: We generated a novel humanized mouse model of skin fibrosis based on the concomitant expression of human PDGFRα and injection of stimulatory anti-PDGFRα antibodies. This mouse model may be useful for identification and preclinical validation of new therapeutic strategies for SSc.

ABSTRACT (Ita) Introduzione: Il recettore del PDGFα (fattore di crescita derivato dalle piastrine) è un target della risposta autoimmune nella sclerosi sistemica (SSc). Sia le IgG totali purificate da siero (SSc-IgG) che gli anticorpi anti-PDGFRα clonati da cellule B della memoria di pazienti sclerodermici (SSc-Mabs) [Moroncini G. et al., A&R 2015] hanno mostrato la capacità di incrementare la trascrizione del gene del collagene in fibroblasti ottenuti dalla cute di donatori sani e di indurre fibrosi ex vivo, su cute trapiantata in topi SCID [Luchetti M. et al., A&R 2016]. Al fine di riprodurre questi risultati in vivo, abbiamo generato topi transgenici per il PDGFRα umano. Materiali e Metodi: L’intera sequenza cDNA del PDGFRα umano è stata clonata nel locus ad espressione ubiquitaria Rosa26 a livello del cromosoma 6 murino ed inserita in cellule staminali embrionali (ES) prelevate da topi C57BL/6. I cloni cellulari geneticamente modificati sono stati selezionati per la microiniezione nella blastocisti, con successiva produzione di topi chimerici. Topi eterozigoti C57BL/6 transgenici per il PDGFRα umano della generazione F2 sono stati utilizzati per stabilire la colonia. Topi maschi di dodici settimane sono stati inoculati a livello della cute del dorso, al giorno 0, 3, 6 e 9, con 0.02 mg/ml di SSc-Mabs (VHPAM-Vκ16F4 or VHPAM-Vκ13B8), o con 2 mg/ml di SSc-IgG o di IgG purificate dal siero di donatori sani (HD-IgG). Parallelamente sono stati inoculati topi controllo con la soluzione veicolo (PBS). Topi C57BL/6 wild type della stessa età e sesso sono stati usati come controlli. Tutti gli animali sono stati sacrificati al giorno 14. Nei tessuti di cute prelevati sono stati analizzati l’espressione del transgene PDGFRα umano e la quantità di collagene. Allo scopo di indurre fibrosi sistemica, sono state inoltre impiantate a livello della cute del dorso degli animali per 28 giorni minipompe osmotiche contenenti 200 μl di PBS come soluzione veicolo o di anticorpo monoclonale SSc-Mab VHPAM-Vκ16F4 (100 μg) o SSc-Mab VHPAM-Vλ16F4 (100 μg) o della miscela di SSc-Mabs VHPAM-Vκ16F4 e VHPAM-Vλ16F4 (50 μg + 50 μg). I topi sono stati sacrificati al giorno 28. Sui tessuti di cute e polmone prelevati sono stati valutati i livelli di collageno, i macrofagi a fenotipo M2 e la deposizione di actina del muscolo liscio (α-SMA). Risultati: I topi transgenici sono risultati fenotipicamente normali, fertili e non hanno mostrato apparenti caratteristiche patologiche. L’espressione del PDGFRα umano sia come mRNA che come proteina è stata rilevata nella cute di tutti i topi transgenici. L’iniezione intradermica dell’anticorpo monoclonale umano stimolatorio SSc-Mab VHPAM-Vκ16F4 o di SSc-IgG ha determinato un ispessimento del derma ed una aumentata deposizione di collagene, mentre l’anticorpo monoclonale umano non stimolatorio SSc-Mab VHPAM-Vκ13B8 o le HD-IgG non hanno indotto alcuna significativa alterazione della cute rispetto al PBS. I topi C57BL/6 wild type non hanno mostrato alcun cambiamento significativo della cute con tutti gli anticorpi inoculati. La somministrazione continua a livello sottocutaneo dell’anticorpo monoclonale SSc-Mab VHPAM-Vκ16F4 o SSc-Mab VHPAM-Vλ16F4 o della miscela dei due ha determinato un ispessimento del derma ed una aumentata deposizione di collagene a livello della cute. Inoltre nel tessuto polmonare è stato evidenziato un aumento di collagene a livello perivascolare e peribronchiolare, con aree di infiammazione caratterizzate dalla presenza di macrofagi a fenotipo M2 e piccoli capillari con cellule endoteliali α-SMA positive. Conclusioni: Abbiamo generato un nuovo modello murino umanizzato di fibrosi cutanea grazie alla concomitante espressione del PDGFRα umano e all’inoculo di anticorpi stimolatori anti-PDGFRα umano. Questo modello murino può essere utile per l’identificazione e la validazione preclinica di nuovi approcci terapeutici per la cura della sclerodermia.