Characterization of a transcription factor controlling vitamin B3 metabolism in plant growth promoting rhizobacteria

Rhizobacteria are able to colonize plant roots at all stages of plant growth, in the presence of a competing microflora. Within this group, plant growth promoting rhizobacteria (PGPRs) establish a beneficial interaction with roots, enhancing host growth and development. Experimental evidence shows that the synthesis of the biologically active form of vitamin B3, i.e. the coenzyme NAD, is directly involved in PGPRs mediated plant growth. Indeed, in Burkolderia sp. strain PsJN, a potato symbiotic PGPR, the enzyme quinolinate phosphoribosyltransferase, which catalyzes a key step in the de novo NAD biosynthetic pathway, is fundamental to promote the plant growth. Based on this evidence, this work focused on the study of the regulation of the de novo NAD biosynthetic pathway in PGPRs with the aim to enhance our knowledge on PGPR-plant interaction and to disclose novel tools to improve plant growth. Bioinformatic analyses showed that in PGPRs the pathway is controlled by the transcriptional regulator NadQ. To fully characterize this regulator, we produced the recombinant protein from A. tumefaciens and through mobility shift assays, we validated its binding to DNA, in a region upstream of the operon involved in the first steps of the de novo NAD biosynthesis. We found that NadQ binds DNA in ATP- and NAD- dependent manner. The resolution of the crystal structures of the regulator in its apo-form and in complex with ATP and DNA provided a first view of the structural mechanism of the release of the protein from DNA. Finally, we showed that in Bordetella species, NadQ regulates the de novo NAD biosynthesis by also controlling the transport of the NAD precursor quinolinic acid across the cellular membrane. We characterized the transporter by thermal shift assay, revealing its ability to bind quinolinic acid with high affinity.

I rizobatteri sono in grado di colonizzare le radici delle piante in tutte le sue fasi di crescita, in presenza di una microflora competitiva. All'interno di questo gruppo di batteri, le specie che promuovono la crescita delle piante (PGPR) stabiliscono un'interazione benefica con le radici, migliorando la crescita e lo sviluppo dell'ospite. Evidenze sperimentali hanno dimostrato che la sintesi della forma biologicamente attiva della vitamina B3, cioè il coenzima NAD, è direttamente coinvolta negli effetti benefici mediati dai PGPR. Infatti, in Burkolderia sp. ceppo PsJN, un PGPR simbiotico della patata, l’attività dell’enzima chinolinato fosforibosiltransferasi che catalizza una reazione chiave nella via biosintetica de novo del NAD, è essenziale per promuovere la crescita della piantea. Il lavoro di questa tesi si è concentrato sullo studio della regolazione della via biosintetica de novo del NAD nei PGPR, con l'obiettivo di migliorare le nostre conoscenze sull'interazione PGPR-ospite e di ottenere nuovi strumenti in grado di migliorare lo sviluppo e il benessere delle piante. Analisi bioinformatiche hanno mostrato che nei PGPR la via de novo è controllata dal regolatore trascrizionale NadQ. Per caratterizzare questo regolatore abbiamo prodotto la proteina da Agrobacterium tumefaciens in forma ricombinante e, attraverso saggi di mobility shift, abbiamo verificato il suo legame con il DNA, in una regione situata a monte dell'operone coinvolto nelle prime fasi della biosintesi de novo del NAD. Abbiamo scoperto che NadQ lega il DNA in modo ATP e NAD-dipendente. In seguito, la risoluzione delle strutture cristallografiche del regolatore nella sua forma apo e in complesso con ATP e DNA, ha rivelato il meccanismo strutturale alla base della dissociazione della proteina dal DNA. Infine, abbiamo dimostrato che in alcune specie del genere Bordetella, NadQ regola la biosintesi de novo del NAD controllando anche il trasporto attraverso la membrana cellulare dell’acido chinolinico, precursore del NAD stesso. Abbiamo caratterizzato questo trasportatore mediante analisi di thermal shift, dimostrando la sua capacità di legare l'acido chinolinico con un’elevata affinità.