Development of Efficient Regeneration and Genetic Engineering Methods through Organogenesis and Somatic Embryogenesis in Prunus spp and Vitis spp.

Conventional breeding for genetic improvement of woody fruit crops is a slow and difficult process, with drawbacks caused in general by high heterozygosity, extended juvenile periods and auto-incompatibility. Furthermore, advancement of woody fruit species using these methods is a long-term effort because of their long generation time. Hence, the need to employ genetic engineering techniques for improvement of quality and induction of resistance to pests and diseases is of utmost importance. Peach GF677 rootstock is very recalcitrant, none the less we managed to obtain genetically transformed cell lines (Calli). Comparing the two genetic transformation methods employed, Agrobacterium-mediated was the most promising, as there was no transgene expression in biolistic method. GFP alone would have been an ideal selection method, given the stringent rules imposed on transgenic crops with the need to avoid the use of antibiotic resistance genes in genetic engineering methods. Never the less, we found that the use of antibiotics for selection is essential for the efficient selection of transformed cells as it inhibits the surrounding non transformed cells from multiplying. Somatic embryogenesis is a cumbersome time consuming process additionally, the choice of explant for its induction in grapevine is strongly genotype dependent. However, once successfully induced, somatic embryos are efficient explants for genetic transformation; as the resulting transgenic plants are devoid of chimeras and true to type. Genetic transformation efficiency of somatic embryos varies across genotypes. When comparing the efficiency of reporter genes GFP (fluorescent protein from Aequorea victoria) and VvMybA1, (anthocyanin biosynthesis gene) it was evident that although GFP is the most commonly applied reporter gene in grapevine transformation trials, VvMybA1 is equally an efficient reporter gene and has an advantage over GFP as it can be observed with naked eye without the need for a specialised instrument. In addition, it can be applied in cisgenesis and intragenesis which are new plant genetic engineering trends. In conclusion, successful genetic transformation of recalcitrant genotypes in fruit tree species is still a challenge for plant biotechnologists. Therefore, research should be more focused on ways of ensuring that plant cells are competent for both regeneration and genetic transformation.

Il breeding convenzionale per il miglioramento genetico delle piante da frutto è un processo lento e difficile, con inconvenienti causati generalmente da elevata eterozigosi, periodi giovanili estesi e autoincompatibilità. Inoltre, il miglioramento delle piante da frutto attraverso l'impiego di questi metodi è un impegno a lungo termine considerando il loro lungo tempo di generazione. Da qui la necessità di impiegare tecniche di ingegneria genetica per incrementare la qualità del frutto e per indurre resistenza a parassiti e malattie. Il portinnesto di pesco GF677 è molto recalcitrante, tuttavia siamo riusciti ad ottenere linee cellulari geneticamente transformate (Calli). Confrontando i due metodi di transformazione genetica impiegati, quello mediato da Agrobacterium è stato il più incorraggiante considerando il fatto che non c'è stata espressione del transgene nel metodo biolistico. La sola GFP potrebbe essere un metodo di selezione ideale considerando le rigide regole che sono imposte alle colture transgeniche ottenute mediante ingegneria genetica in cui è necessario evitare l'utilizzo di geni di resistenza agli antibiotici. Tuttavia abbiamo scoperto che l'uso di antibiotici è essenziale per un'efficiente selezione delle cellule transformate poichè inibisce la moltiplicazione delle cellule non transformate circostanti. L'embriogenesi somatica è un processo complesso che richiede tempo, inoltre al fatto che la scelta dell'espianto per la sua induzione in vite è fortemente dipendente dal genotipo. Tuttavia, una volta indotti con successo, gli embrioni somatici sono espianti efficienti per la trasformazione genetica; nelle piante transgeniche risultanti non vi è chimerismo. L'efficienza di trasformazione genetica degli embrioni somatici varia da un genotipo all'altro. Confrontando l'efficienza dei geni reporter GFP (gene che codifica per la proteina fluorescente verde da Aequorea victoria) e VvMybA1 (gene coinvolto nella biosintesi dell'antocianina) è stato evidente che sebbene il gene GFP sia il reporter più comunemente impiegato negli studi di trasformazione della vite, anche VvMybA1 è un efficiente gene reporter e ha un vantaggio rispetto a quello codificante per la GFP in quanto può essere osservato ad occhio nudo senza la necessità di uno strumento specializzato. Inoltre, può essere applicato nella cisgenesi e nell'intragenesi che sono nuovi trend di ingegneria genetica vegetale. In conclusione, una trasformazione genetica di successo dei genotipi recalcitranti di specie di alberi da frutto è tutt'ora una sfida per i biotecnologi vegetali. Pertanto, la ricerca dovrebbe essere soprattutto mirata a garantire che le cellule vegetali abbiano la competenza sia per la rigenerazione che per la trasformazione genetica.