Ricerca di cellule vitali di Legionella pneumophila in campioni di acqua sanitaria e termale: sviluppo e applicazione di un metodo di viability qPCR

INTRODUZIONE- Premesse e scopo dello studio Regolari monitoraggi per la presenza di Legionella ed appropriate misure di controllo sugli impianti idrici costituiscono efficaci strategie di prevenzione in ambienti in cui si può verificare l’esposizione di soggetti a rischio. Un approccio promettente per la ricerca di legionelle vitali in campioni di acqua è la “viability PCR”, tecnica che utilizza un pretrattamento con molecole intercalanti il DNA, fotoattivazione per stabilire il legame covalente con l’acido nucleico che ne inibisce l’amplificazione, e qPCR. Lo scopo di questo studio è stato quello di sviluppare tale metodo di pretrattamento e di rilevazione molecolare di legionelle vitali, applicandolo quindi in campioni di acqua di strutture sanitarie e termale. MATERIALI E METODI Sono state inizialmente ottimizzate tutte le condizioni per il pretrattamento del campione con intercalante Pemax (GenIUL): concentrazione, buffer, tempi e temperatura di incubazione. E’ stata quindi effettuata una comparazione tra il trattamento di cellule di Legionella in sospensione, ricavate da filtro dopo il passaggio dell’acqua, o direttamente su membrana. Il protocollo più efficace è stato valutato su campioni di acqua artificialmente contaminati contenenti concentrazioni variabili di cellule di Legionella vive e morte. Infine, campioni di acqua da torri di raffreddamento di strutture sanitarie e termale sono stati testati in parallelo con il metodo colturale ISO11731:2017 e con il metodo molecolare sviluppato (Diatheva). RISULTATI Il protocollo di pretrattamento definitivo prevede l’incubazione di Legionella in sospensione, in Standard buffer contenente 12.5 μM di intercalante, per 20 min a temperatura ambiente. Il metodo è in grado di distinguere cellule vive e morte di Legionella in rapporto 1:1, 1:10 e 1:100, in un range da 104 a 106 CFU. Prove effettuate su acqua da torri di raffreddamento, artificialmente contaminata, evidenziano una riduzione di 1-2 log nell’amplificazione di cellule morte, rispetto ai controlli. Il metodo, quando applicato sui campioni reali di acqua sanitaria e termale, a fronte di un livello molto basso o assenza di contaminazione ottenuto con la tecnica colturale (<100 CFU/L), rileva la presenza di un numero molto più elevato (107-105/L) di cellule vive. CONCLUSIONI La discrepanza dei risultati tra ricerca colturale e viability PCR nelle acque sanitarie e termali può essere ascrivibile alla presenza di forme VBNC o ad una non accessibilità al trattamento dei batterinel campione reale. Il metodo richiede ulteriore ottimizzazione per poter essere applicato in maniera più affidabile su campioni reali.