Development of new molecular tools for the characterization of human Granulosa cells: new implications for the research on human infertility

In assisted reproductive routine, oocyte selection is based on its morphological features, which seem not to be related to its intrinsic competence. Hence, several efforts have been made to identify markers to be added to the actual evaluation, in particular focusing on the crucial roles of Granulosa cells (GCs) in the follicular microenvironment: production of estradiol and progesterone, regulation of the meiosis steps and the transcriptional activity in the oocyte, production of essential nutrients for the oocyte, and accumulation of secreted metabolites. Hence, the progression through the steps of folliculogenesis heavily relies upon bi-directional interactions between germ cells and the surrounding somatic cells. The study of GCs has shown to be determining to highlight particular features of ovarian mechanisms and folliculogenesis, and also to identify the endogenous and exogenous factors that can impair these delicate processes. In this sense, the main aim of the PhD project was to characterize GCs, applying for the first time Fourier Transform Infrared Microspectroscopy (FTIRM) to develop a method for evaluating the quality of human oocytes. This could represent a new, reliable and objective tool for oocyte quality assessment in assisted reproduction routine. Besides this main topic, the impairment induced by endogenous and exogenous factors on the biochemical composition, metabolism and cellular activity of GCs was also investigated by FTIRM, Raman Microspectroscopy and qPCR, shedding new light on the mechanisms governing folliculogenesis. In particular, the research was focused on the impairment determined by reproductive aging, ovarian endometriosis, and plastic pollutants. The information obtained on GCs contribute to the understanding of the mechanisms of impairment of folliculogenesis, by a multidisciplinary approach made of spectroscopic analysis and qPCR. Thanks to the results, an innovative approach to evaluate oocyte quality by spectral features of GCs was proposed, suggesting the possibility to apply FTIRM as a clinical feasible diagnostic tool in assisted reproduction routine.

Nella routine della riproduzione assistita, la selezione degli ovociti si basa sulle loro caratteristiche morfologiche, nonostante la scarsa correlazione tra tali parametri e la competenza dell’ovocita. Pertanto, la ricerca si sta concentrando sull’identificazione di marker che possano supportare l’attuale metodica di valutazione, in particolare studiando le cellule della Granulosa (GCs), che svolgono compiti fondamentali all’interno del microambiente del follicolo: produzione di estradiolo e progesterone, regolazione dell’avanzamento della meiosi e dell’attività trascrizionale dell’ovocita, produzione di nutrienti essenziali per l’ovocita, e accumulo di metaboliti secreti. Pertanto, la progressione degli step della follicologenesi dipende strettamente dalla comunicazione bidirezionale tra ovocita e le cellule somatiche che lo circondano. Lo studio delle GCs ha messo in luce molti aspetti circa le funzionalità ovariche, la follicologenesi, e i meccanismi con cui fattori endogeni ed esogeni possono alterare questi delicati processi. In questo senso, lo scopo principale del presente PhD è stato quello di caratterizzare le GCs, applicando per la prima volta la tecnica Fourier Transform Infrared Microspectroscopy (FTIRM), in modo da sviluppare un nuovo metodo per valutare la qualità degli ovociti umani. Questo potrebbe rappresentare uno strumento nuovo, affidabile e oggettivo per la valutazione della qualità degli ovociti nella routine della riproduzione assistita. Oltre al tema principale, sono state applicate le tecniche FTIRM, Raman Microspectroscopy e qPCR per studiare i meccanismi di intaccamento del metabolismo, della composizione biochimica e dell’attività cellulare causati da fattori endogeni ed esogeni, in particolare l’invecchiamento riproduttivo, l’endometriosi ovarica e inquinanti plastici. Le informazioni ottenute su queste cellule contribuiscono alla comprensione dei meccanismi di danneggiamento della follicologenesi, tramite un approccio multidisciplinare che ha visto l’accoppiamento di analisi spettroscopiche e qPCR. Grazie ai risultati ottenuti, è stato proposto un approccio innovativo per l’analisi della qualità degli ovociti tramite caratteristiche spettrali delle GCs, suggerendo la possibilità di un’applicazione dell’FTIRM come strumento diagnostico di facile utilizzo nella routine di riproduzione assistita.