Structural and aggregation properties of bovine α1-acid glycoprotein, a member of the lipocalin superfamily

α1-Acidglycoprotein (AGP) is an important member of the acute phase response involved in drug binding and modulation of the immune system. AGP belongs to the lipocalin superfamily, a wide group of proteins sharing a strikingly conserved β-barrel fold that serves as a binding site for a large number of hydrophobic and neutral molecules. Several biological functions have been associated to AGP, both in vivo and in vitro. AGP is able to bind and transport a wide number of hydrophobic molecules. Potential therapeutic uses of AGP in the treatment of immune diseases have been envisioned, including, for instance, reduction of histamine levels. In the light of these observations, a detailed knowledge of the structure and stability of AGP appears essential. Fourier-Transform infrared (FT-IR) spectroscopy has been extensively used in the investigation of AGP due to its sensitivity towards fluctuations within protein structures. A survey of several environmental conditions, including pH and disulfide redox state, has shown that strongly acidic and reducing environments induce concomitant denaturation and aggregation of the polypeptide chain following increases in temperature. My doctoral research has been undertaken to characterize AGP aggregates obtained in the presence of the disulfide-specific reducing agents. The binding of Thioflavin T dye indicate that the aggregates possess a cross-β motif, suggesting that they are amyloid in nature. A molecular interpretation on the fibrillation kinetics of AGP was proposed. The experimental data do not show a nucleation-dependent polymerization mechanism otherwise they suggest a downhill polymerization mechanism as described for transthyretin and serum albumin. In this model, an aggregation-prone species self-assembles to form the amyloid fibrils. Further support to the downhill polymerization mechanism was provided by the seeding experiments and a more accurate kinetic analysis of fibril formation.

Lo studio delle proprietà strutturali e funzionali della α1-glicoproteina acida (AGP) costituisce l’oggetto di questa tesi. L’AGP rappresenta, dopo l’albumina, la più abbondante proteina nel plasma. Essa appartiene alla famiglia delle lipocaline, un ampio gruppo di proteine caratterizzato da una struttura centrale a barile β (β-barrel) che funge da sito di legame per numerose molecole ad attività biologica. E’ stata dimostrata l’applicabilità biotecnologica dell’AGP nel campo dello sviluppo di nuovi biosensori e delle purificazioni industriali. Durante il mio dottorato, è stata condotta un’ampia analisi riguardante numerosi fattori ambientali (pH, stato ossidoriduttivo, temperatura), la quale ha mostrato che valori di pH debolmente o fortemente acidi e/o condizioni riducenti, inducono la concomitante denaturazione e aggregazione delle catene polipeptidiche in seguito all’aumento della temperatura. Da queste osservazioni si è passati alla caratterizzazione delle forme aggregate dell’AGP ottenute in specifiche condizioni di pH, temperatura e stato ossidoriduttivo. La capacità, di questi aggregati, di legare la Tioflavina T indica che tali forme aggregate sono di natura amiloide. Indagini più mirate sono state condotte sulla cinetica di formazione delle fibrille, da cui ricavare parametri cinetici utili nell’individuare un possibile modello di aggregazione. È importante notare che le analisi cinetiche non mostrano la presenza di una fase di nucleazione, il che esclude il modello di polimerizzazione dipendente da nucleazione. In questo modello, il passaggio limitante, è rappresentato dalla formazione di un nucleo che funge da innesco critico per l’intero processo di fibrillazione. Dati sperimentali hanno evidenziato la mancanza di questa fase, il ché suggerisce un meccanismo a cascata, in cui lo step critico è rappresentato dalla conversione del monomero stabile in monomero ‘attivato’, il quale è più propenso all’aggregazione e si assembla in strutture fibrillari.