Quantificazione della Nicotinamide Riboside e dei suoi precursori NMN e NAD nel latte mediante un nuovo saggio enzimatico fluorimetrico

QUANTITATION OF NICOTINAMIDE RIBOSIDE AND ITS PRECURSORS NMN AND NAD IN MILK, THROUGH A NOVEL ENZYMATIC FLUOROMETRIC ASSAY. Nicotinamide Riboside (NR) is a form of vitamin B3 that can be found as such in the diet or formed from dietary NAD (Nicotinamide Adenine Dinucleotide) and/or NMN (Nicotinamide Mononucleotide) by the combined action of enzymes from the intestinal mucosa and gut microbiota. Recent studies demonstrated that administration of NR and NMN to mice is able to boost intracellular NAD levels resulting in multiple health benefits, including protection against damage to nerves, hearing loss, age-related disorders, metabolic and mitochondrial diseases. The lack of suitable assays to accurately quantitate the amount of NR and NMN in complex matrices has limited so far the assessment of these molecules in food sources. Here, we introduce a novel, sensitive, rapid and economical enzyme-coupled assay for the simultaneous quantitation of NR, NMN and NAD. The assay was tested to measure the concentration of the three analytes in milk collected from different species including, buffalo, bovine, ewe, caprine, donkey, and human. The results showed that NR, both as such and in the form of dietary precursors, accounts for a significant fraction of the total vitamin B3 content. Furthermore, the assay allowed us to evaluate the thermal stability of the vitamin upon heating treatment, showing that NR is resistant to pasteurization, but it is fully destroyed by UHT processing. Interestingly, by studying the analytes’ content in human milk at different lactation times, we observed rhythmic fluctuations of NAD over the 24 h, which is in keeping with the circadian intracellular synthesis of the coenzyme. Finally, the assay was also optimized to measure the analytes in fermented foods, like kefir and beer. This study might pave the way to a better understanding of the distribution of NR, NMN and NAD among different food-types, and to design better processing technologies able to preserve the vitamin and its precursors.

QUANTIFICAZIONE DELLA NICOTINAMIDE RIBOSIDE E DEI SUOI PRECURSORI NMN E NAD NEL LATTE, MEDIANTE UN NUOVO SAGGIO ENZIMATICO FLUORIMETRICO. La Nicotinammide Riboside (NR), è una forma della vitamina B3 che può essere assunta come tale con la dieta o può derivare dalla digestione del NAD (Nicotinammide Adenin Dinucleotide) e/o dell’NMN (Nicotinammide Mononucleotide) ad opera degli enzimi della flora o della mucosa intestinale. Una volta assorbita, la vitamina viene convertita a NAD, che ne rappresenta la forma biologicamente attiva. Studi recenti hanno dimostrano che la somministrazione di NR e NMN a modelli murini determina un significativo aumento dei livelli intracellulari di NAD, con conseguente protezione nei confronti di disordini di varia natura, metabolici, mitocondriali e nervosi. La mancanza, ad oggi, di saggi adatti alla quantificazione di NR e NMN in matrici complesse ha limitato l’analisi di queste molecole negli alimenti. Qui presentiamo un saggio enzimatico accoppiato, sensibile, rapido ed economico, che consente la quantificazione simultanea di NR, NMN e NAD. Il saggio è stato applicato all’analisi dei tre analiti in latti di diverse specie animali, compreso l’uomo. I risultati hanno dimostrato che NR, sia come tale, sia sotto forma dei suoi precursori, contribuisce in maniera significativa al contenuto totale di vitamina B3. Il saggio ha anche permesso di valutare la stabilità della vitamina ai trattamenti termici HTST e UHT, rivelando che NR è resistente alla pastorizzazione, ma è completamente distrutta dal trattamento UHT. L’analisi del contenuto di NAD nel latte umano a diversi tempi di lattazione ha mostrato oscillazioni ritmiche dei livelli della molecola nelle 24 ore, in accordo con il ritmo circadiano di sintesi del coenzima. Il saggio è stato anche ottimizzato per la determinazione dei tre analiti in alimenti fermentati, come kefir e birra. Questo studio sarà strumentale alla comprensione della distribuzione di NR, NMN e NAD nei vari alimenti, anche al fine di impiegare i migliori processi tecnologici per preservare le proprietà della vitamina.