The aim of this work was to study the efficacy of alternative biological treatments for endometritis in the equine and bovine species. Endometritis is an inflammation of the uterine lining that causes decreased fertility. The biological treatments studied include the conditioned medium derived from equine amniotic membrane-derived mesenchymal stem cells (AMCs) (AMCs-CM), and bovine platelet-rich plasma (PRP). PRP is a preparation of concentrated platelet-derived bio-active factors isolated from blood. Both treatments have the potential to modulate the inflammatory response thus increasing the cure rate and consequently pregnancy rate. Based on this, AMCs and cells isolated from endometrium (EDCs) at diestrus were studied for their proliferative capacity. EDCs were then co-cultured with AMCs in a transwell system or grown in the presence of AMCs-CM to understand whether AMCs could induce endometrial cells to proliferate through the release of paracrine agents. Lastly, the amniotic membrane in toto and AMCs (at different passages) have been compared with the endometrial tissue (at diestrus stage) in toto and cells isolated from it, respectively, for the expression of early pregnancy-associated genes (Hoxa9, Wnt7a, Wnt4a, PGR, ERα, ERβ, PGRMC1 and mPR). In addition, since in vivo amniotic cells within the amniotic membrane are probably influenced by progesterone during pregnancy, AMCs were cultured also in the presence of progesterone. This is also important because the phenotype of the isolated AMCs should be more possibly similar to the endometrial cells for their use in replacement therapy. This study highlights a substantial overlap between equine amnion and endometrium based on gene expression profiling. Furthermore the present study demonstrates that soluble signals produced by AMCs promote EDCs proliferation. To explore the potential of PRP in bovine endometrial regeneration, its effect on the proliferation of endometrial cells and on the expression of genes involved in the regulation of oestrus cycle and fetal-maternal interaction (PTGS2, TP53, ERα, ERβ and PR) were evaluated. Bovine endometrial-derived cells were cultured in vitro until passage (P) 10 with two different concentrations of PRP (5% and 10%). These data were compared to control cells, cultured with 10% fetal bovine serum (FBS) only. We observed that 5% PRP at passage 5 increased proliferation rate of endometrial cells and induce a significant increase in the expression of all studied genes compared to 10% PRP or 10% FBS. In a second step, endometrial cells were treated in vitro with two different concentrations of bacterial endotoxin lipopolysaccharide (LPS) (nominally 10 and 100 ng/ml) and subsequently with 5% PRP for 1, 6, 12, 24 and 48 h. The ability of PRP to counteract in vitro inflammation of endometrial cells induced by LPS was studied by evaluating the expression of pro-inflammatory genes (IL-1β, IL-8, iNOS, PTGS2 and CXCL5). PRP treatment had a significant effect on the endometrial expression of pro-inflammatory genes. In fact, the expression of all genes studied was found significantly decreased in cells treated with PRP compared to untreated cells. These findings make AMCs, its conditioned medium and PRP suitable candidates for the treatment of endometritis in large animals.

L’obiettivo di questo lavoro è stato quello di studiare l’efficacia di trattamenti biologici alternativi per la cura dell’endometrite nelle specie equina e bovina. Per endometrite si intende un processo infiammatorio che coinvolge l’endometrio. L’endometrite costituisce una delle più frequenti cause di ridotta fertilità. In particolare, i trattamenti biologici che abbiamo studiato includono l’uso di terreno condizionato da cellule staminali mesenchimali isolate dalla membrana amniotica equina (CM-AMCs) e il plasma arricchito di piastrine (PRP), che è un concentrato di fattori bioattivi derivato dalle piastrine isolate da sangue bovino. è stato ipotizzato che questi trattamenti siano capaci di modulare la risposta infiammatoria facendo così aumentare il tasso di guarigione e di conseguenza il tasso di gravidanza. Sulla base di questa ipotesi, è stato studiato l’effetto diretto di AMCs equine sulla capacità proliferativa di cellule isolate dallo stroma dell’endometrio equino in fase di diestro (EDCs) attraverso il ricorso a i) sistemi transwell per la co-cultura delle EDCs con AMCs e a ii) colture di EDCs in presenza CM-AMCs. Studi comparativi tra amnios in toto (AM) e tessuto endometriale (in fase di diestro) in toto (ED) e tra AMCs e EDCs relativi all’espressione di geni associati alla fase inziale della gravidanza (Hoxa9, Wnt4a-7a, ERα, ERβ, PGR, PGRMC1 e mPR) hanno permesso di identificare similarità tra le popolazioni cellulari e i tessuti da cui derivano. Inoltre, si è pensato di ricreare in vitro una condizione di coltura per le AMCs più vicina possibile alle condizioni in vivo durante la gravidanza ed è per questo che le AMCs sono state coltivate anche in presenza di progesterone. Dai risultati è emerso che sia l’AM sia le AMCs mostrano caratteristiche molecolari comparabili rispettivamente con l’ED e l’EDCs. Inoltre è stato dimostrato che i segnali solubili prodotti dalle AMCs promuovono la proliferazione delle EDCs sia quando queste due linee cellulari sono co-coltivate in transwell sia quando le EDCs sono coltivate in presenza di CM-AMCs. Per esplorare il potenziale del PRP sulla rigenerazione dell’endometrio bovino, abbiamo valutato il suo effetto sulla proliferazione delle cellule endometriali e sull’espressione dei geni coinvolti nella regolazione del ciclo estrale e nell’interazione materno-fetale (ERα, ERβ, PR, TP53 e PTGS2). Le cellule isolate da endometrio bovino sono state coltivate in vitro fino al passaggio (P) 10 in presenza di due diverse concentrazioni di PRP (5% e 10%). Le cellule di controllo sono state coltivate in presenza del 10% di siero fetale bovino (FBS). I risultati ottenuti indicano che il PRP al 5%, a P5, aumenta il tasso di proliferazione delle cellule endometriali e induce un aumento significativo dell’espressione dei geni studiati rispetto al 10% di PRP o FBS. Le cellule endometriali sono state poi trattate in vitro con due diverse concentrazioni dell’endotossina batterica lipopolisaccaride (LPS) (10 e 100 ng/ml) e successivamente con PRP al 5% per 1, 6, 12, 24 e 48 ore. La capacità del PRP di contrastare in vitro l’infiammazione delle cellule endometriali indotta da LPS è stata valutata studiando l’espressione di alcuni geni pro-infiammatori (IL-1β, IL-8, iNOS, PTGS2 e CXCL5). È stata osservata una significativa diminuzione dell’espressione dei geni pro-infiammatori nelle cellule trattate con PRP rispetto alle cellule che non hanno subito nessun trattamento. In generale, i risultati ottenuti dimostrano che le AMCs, i loro prodotti solubili e il PRP rappresentano candidati ottimali per il trattamento dell’endometrite nei grandi animali.

In vitro assessment of different regenerative therapeutic approaches in animal reproductive medicine / Marini, Maria Giovanna. - (2016 Feb 17).

In vitro assessment of different regenerative therapeutic approaches in animal reproductive medicine

Marini, Maria Giovanna
2016-02-17

Abstract

The aim of this work was to study the efficacy of alternative biological treatments for endometritis in the equine and bovine species. Endometritis is an inflammation of the uterine lining that causes decreased fertility. The biological treatments studied include the conditioned medium derived from equine amniotic membrane-derived mesenchymal stem cells (AMCs) (AMCs-CM), and bovine platelet-rich plasma (PRP). PRP is a preparation of concentrated platelet-derived bio-active factors isolated from blood. Both treatments have the potential to modulate the inflammatory response thus increasing the cure rate and consequently pregnancy rate. Based on this, AMCs and cells isolated from endometrium (EDCs) at diestrus were studied for their proliferative capacity. EDCs were then co-cultured with AMCs in a transwell system or grown in the presence of AMCs-CM to understand whether AMCs could induce endometrial cells to proliferate through the release of paracrine agents. Lastly, the amniotic membrane in toto and AMCs (at different passages) have been compared with the endometrial tissue (at diestrus stage) in toto and cells isolated from it, respectively, for the expression of early pregnancy-associated genes (Hoxa9, Wnt7a, Wnt4a, PGR, ERα, ERβ, PGRMC1 and mPR). In addition, since in vivo amniotic cells within the amniotic membrane are probably influenced by progesterone during pregnancy, AMCs were cultured also in the presence of progesterone. This is also important because the phenotype of the isolated AMCs should be more possibly similar to the endometrial cells for their use in replacement therapy. This study highlights a substantial overlap between equine amnion and endometrium based on gene expression profiling. Furthermore the present study demonstrates that soluble signals produced by AMCs promote EDCs proliferation. To explore the potential of PRP in bovine endometrial regeneration, its effect on the proliferation of endometrial cells and on the expression of genes involved in the regulation of oestrus cycle and fetal-maternal interaction (PTGS2, TP53, ERα, ERβ and PR) were evaluated. Bovine endometrial-derived cells were cultured in vitro until passage (P) 10 with two different concentrations of PRP (5% and 10%). These data were compared to control cells, cultured with 10% fetal bovine serum (FBS) only. We observed that 5% PRP at passage 5 increased proliferation rate of endometrial cells and induce a significant increase in the expression of all studied genes compared to 10% PRP or 10% FBS. In a second step, endometrial cells were treated in vitro with two different concentrations of bacterial endotoxin lipopolysaccharide (LPS) (nominally 10 and 100 ng/ml) and subsequently with 5% PRP for 1, 6, 12, 24 and 48 h. The ability of PRP to counteract in vitro inflammation of endometrial cells induced by LPS was studied by evaluating the expression of pro-inflammatory genes (IL-1β, IL-8, iNOS, PTGS2 and CXCL5). PRP treatment had a significant effect on the endometrial expression of pro-inflammatory genes. In fact, the expression of all genes studied was found significantly decreased in cells treated with PRP compared to untreated cells. These findings make AMCs, its conditioned medium and PRP suitable candidates for the treatment of endometritis in large animals.
17-feb-2016
L’obiettivo di questo lavoro è stato quello di studiare l’efficacia di trattamenti biologici alternativi per la cura dell’endometrite nelle specie equina e bovina. Per endometrite si intende un processo infiammatorio che coinvolge l’endometrio. L’endometrite costituisce una delle più frequenti cause di ridotta fertilità. In particolare, i trattamenti biologici che abbiamo studiato includono l’uso di terreno condizionato da cellule staminali mesenchimali isolate dalla membrana amniotica equina (CM-AMCs) e il plasma arricchito di piastrine (PRP), che è un concentrato di fattori bioattivi derivato dalle piastrine isolate da sangue bovino. è stato ipotizzato che questi trattamenti siano capaci di modulare la risposta infiammatoria facendo così aumentare il tasso di guarigione e di conseguenza il tasso di gravidanza. Sulla base di questa ipotesi, è stato studiato l’effetto diretto di AMCs equine sulla capacità proliferativa di cellule isolate dallo stroma dell’endometrio equino in fase di diestro (EDCs) attraverso il ricorso a i) sistemi transwell per la co-cultura delle EDCs con AMCs e a ii) colture di EDCs in presenza CM-AMCs. Studi comparativi tra amnios in toto (AM) e tessuto endometriale (in fase di diestro) in toto (ED) e tra AMCs e EDCs relativi all’espressione di geni associati alla fase inziale della gravidanza (Hoxa9, Wnt4a-7a, ERα, ERβ, PGR, PGRMC1 e mPR) hanno permesso di identificare similarità tra le popolazioni cellulari e i tessuti da cui derivano. Inoltre, si è pensato di ricreare in vitro una condizione di coltura per le AMCs più vicina possibile alle condizioni in vivo durante la gravidanza ed è per questo che le AMCs sono state coltivate anche in presenza di progesterone. Dai risultati è emerso che sia l’AM sia le AMCs mostrano caratteristiche molecolari comparabili rispettivamente con l’ED e l’EDCs. Inoltre è stato dimostrato che i segnali solubili prodotti dalle AMCs promuovono la proliferazione delle EDCs sia quando queste due linee cellulari sono co-coltivate in transwell sia quando le EDCs sono coltivate in presenza di CM-AMCs. Per esplorare il potenziale del PRP sulla rigenerazione dell’endometrio bovino, abbiamo valutato il suo effetto sulla proliferazione delle cellule endometriali e sull’espressione dei geni coinvolti nella regolazione del ciclo estrale e nell’interazione materno-fetale (ERα, ERβ, PR, TP53 e PTGS2). Le cellule isolate da endometrio bovino sono state coltivate in vitro fino al passaggio (P) 10 in presenza di due diverse concentrazioni di PRP (5% e 10%). Le cellule di controllo sono state coltivate in presenza del 10% di siero fetale bovino (FBS). I risultati ottenuti indicano che il PRP al 5%, a P5, aumenta il tasso di proliferazione delle cellule endometriali e induce un aumento significativo dell’espressione dei geni studiati rispetto al 10% di PRP o FBS. Le cellule endometriali sono state poi trattate in vitro con due diverse concentrazioni dell’endotossina batterica lipopolisaccaride (LPS) (10 e 100 ng/ml) e successivamente con PRP al 5% per 1, 6, 12, 24 e 48 ore. La capacità del PRP di contrastare in vitro l’infiammazione delle cellule endometriali indotta da LPS è stata valutata studiando l’espressione di alcuni geni pro-infiammatori (IL-1β, IL-8, iNOS, PTGS2 e CXCL5). È stata osservata una significativa diminuzione dell’espressione dei geni pro-infiammatori nelle cellule trattate con PRP rispetto alle cellule che non hanno subito nessun trattamento. In generale, i risultati ottenuti dimostrano che le AMCs, i loro prodotti solubili e il PRP rappresentano candidati ottimali per il trattamento dell’endometrite nei grandi animali.
Endometritis, platelet-rich plasma, conditioned medium
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