Ecotoxicological potential of Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drugs (NSAIDs) in marine organisms: bioavailability, biomarkers and natural occurrence in Mytilus galloprovincialis

Pharmaceuticals represent a major environmental concern since the knowledge on their occurrence, distribution and ecotoxicological potential is still limited particularly in coastal areas. In this thesis the sensitivity of the Mediterranean mussels Mytilus galloprovincialis toward different Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drugs (NSAIDs) was assessed, applying an integrated approach which combined laboratory studies with field investigation. In laboratory conditions mussels were exposed to different environmental realistic concentrations (25, 2.5 and 0.5 μg/L) of acetaminophen AMP, diclofenac DIC, ibuprofen IBU, ketoprofen KET and nimesulide NIM, for different periods (from 14 to 60 days). The ecotoxicological potential of NSAIDs was evaluated combining chemical analyses on pharmaceuticals bioaccumulation with a multi-biomarker approach, based on a wide array of molecular and subcellular responses reflecting early warning signals of biological disturbance, modulation of specific cellular pathways, onset of various typologies of cellular damages and toxicity. For some experimental condition, functional alteration at cellular level were further integrated with transcriptomic changes at molecular level using DNA microarray. Obtained results demonstrated that mussels are able to bioconcentrate DIC, IBU and NIM without dose dependent response, while AMP and KET are never detected independently from the doses and the exposure period. Nonetheless, for all tested NSAIDs and in all experimental conditions, measurement of a large panel of ecotoxicological biomarkers highlighted impairment of immunological parameters, modulation of lipid metabolism and genotoxic effects. The analyses on transcriptomic profile highlighted changes at molecular level for organisms exposed to lower doses, both in short (for KET and NIM) and long-term condition (for KET). Molecular results supported changes obtained at cellular level and suggest similar mechanisms of action of NSAIDs in mammals and vertebrates. Long-term responses allowed to determine that the effects of anti-inflammatory pharmaceuticals were constantly maintained over 60 days. Field studies provided the first evidence on the occurrence of DIC, IBU and NIM in tissues of wild mussels sampled during summer and spring periods from typical, touristic areas of Central Adriatic Sea. Overall results demonstrated M. galloprovincialis as a good sentinel species toward anti inflammatory pharmaceuticals and the actual ecotoxicological hazard of pharmaceuticals in the Mediterranean.

I residui dei composti farmaceutici presenti in ambiente rappresentano una problematica emergente dato che le informazioni riguardo la loro presenza, distribuzione e potenziale ecotossicologico sono molto limitate, specialmente per le aree costiere. In questa tesi è stata valutata la sensibilità del mitilo Mediterraneo Mytilus galloprovincialis nei confronti di diversi farmaci anti infiammatori non steroidei (FANS), applicando un approccio integrato che ha previsto sia attività di laboratorio che indagini di campo. In condizioni di laboratorio i mitili sono stati esposti a diverse concentrazioni ambientalmente realistiche (25, 2.5 e 0.5 μg/L) di acetaminofene AMP, diclofenac DIC, ibuprofene IBU, ketoprofene KET e nimesulide NIM, per diversi tempi di esposizione (da 14 a 60 giorni). Il potenziale ecotossicologico dei FANS è stato valutato combinando le analisi chimiche del bioaccumulo dei farmaci con un approccio multi-biomarker, basato sullo studio di un ampio numero di risposte subcellulari che rappresentano dei segnali di allerta precoce di alterazione cellulare e di tossicità. Per alcune condizioni sperimentali, le alterazioni funzionali misurate a livello cellulare sono state integrate con modificazioni trascrittomiche a livello molecolare attraverso la tecnica di microarray a DNA. I risultati ottenuti hanno dimostrato che i mitili sono in grado di bioaccumulare DIC, IBU e NIM non seguendo, tuttavia, una cinetica dose dipendente, mentre AMP e KET non sono mai stati misurati indipendentemente dalla dose e dal tempo di esposizione. Ciononostante, tutte le molecole testate e tutte le condizioni sperimentali hanno determinato l’insorgenza di alterazioni a carico dei parametri immunitari, modulazione del metabolismo lipidico e danno genotossico. Le analisi trascrittomiche hanno rivelato modificazioni a carico degli organismi esposti alle dosi più basse, sia nel breve (KET e NIM) che nel lungo termine (KET). I risultati ottenuti a livello molecolare supportano le alterazioni misurate a livello cellulare e suggeriscono che il meccanismo di azione dei FANS negli invertebrati risulta essere molto simile a quello ampiamente documentato nei mammiferi. Le indagini a lungo termine hanno permesso di comprendere che l’effetto dei FANS si mantiene costantemente per 60 giorni. Le indagini in campo hanno rivelato, per la prima volta, la presenza di DIC, IBU e NIM nei mitili naturali campionati in primavera e in estate da tipiche aree turistiche del Mare Adriatico centrale. Complessivamente tutti i risultati hanno dimostrato che il M. galloprovincialis è una buona specie sentinella per i FANS, e il reale pericolo ecotossicologico dei farmaci nel Mediterraneo.