Sviluppo di un metodo enzimatico di analisi per la discriminazione delle vie di utilizzo della vitamina B3 in differenti condizioni metaboliche

DEVELOPMENT OF ENZYMATIC ASSAY FOR THE DISCRIMINATION OF THE PATHWAY FOR THE VITAMIN B3 UTILIZATION IN DIFFERENT METABOLIC CONDITIONS NAD is a key metabolite in cellular metabolism and its homeostasis is the result of a delicate balance between NAD-cleaving and NAD-synthesizing reactions. The decrease of intracellular NAD levels is known to be the trigger of a variety of neurologic and metabolic disorders which can be prevented or contrasted by stimulating NAD salvage synthesis through the administration of NAD itself and/or its vitamin precursors. On the other hand, it has been proven that administration of inhibitors that restrain NAD biosynthesis is an effective tumor suppressing therapy because tumor cells require higher NAD levels to survive compared to normal cells. NAD can be synthesized starting from tryptophan or from the three forms of vitamin B3 through four distinct metabolic routes, which contribute to build up the overall coenzyme pool with different efficiencies and in various combinations depending on the different organism, tissue, cell and metabolic status. Knowledge of the distribution of the regulatory enzymes of each route in various tissues/organs and in different physiopathological conditions has been so far limited, essentially due to the lack of suitable assays for the determination of individual NAD-synthesizing enzyme activities in crude cell extracts. In this work we present an assay that allows the simultaneous determination of the activity of the four target enzymes in different biological samples. The application of the assay in crude extracts prepared from different mouse tissues and human cell lines demonstrated that the assay can be exploited to reconstruct the NAD biosynthetic machinery occurring in the various cell-types. Moreover, the results obtained on an ovarian carcinoma cell line allowed to propose a novel antitumoral strategy based on the combined inhibition of the target enzymes controlling the two metabolic routes that most contribute to the maintenance of NAD levels in this cell line. This combination therapy, tested in vivo on mouse models, resulted in a significant decrease of tumor growth and increase of mice survival.

SVILUPPO DI UN METODO ENZIMATICO DI ANALISI PER LA DISCRIMINAZIONE DELLE VIE DI UTILIZZO DELLA VITAMINA B3 IN DIFFERENTI CONDIZIONI METABOLICHE Il NAD è una molecola chiave del metabolismo cellulare e il mantenimento dei suoi livelli intracellulari è garantito da un equilibrio tra processi enzimatici di sintesi e degradazione. La diminuzione dei livelli del coenzima è spesso associata all’insorgenza di patologie neurologiche e metaboliche ed è possibile prevenire o combattere tali disordini stimolando la rigenerazione del NAD mediante somministrazione del coenzima stesso e/o dei suoi precursori vitaminici. Al contrario, diminuire la biosintesi del NAD si sta rivelando una efficace terapia contro il cancro in quanto le cellule tumorali richiedono maggiori livelli di NAD per la loro sopravvivenza rispetto alle cellule normali. Il NAD può essere sintetizzato a partire dall’amminoacido triptofano o dalle tre forme della vitamina B3 attraverso quattro vie metaboliche distinte, ognuna delle quali contribuisce con diversa efficienza al mantenimento dei livelli del coenzima in base al tipo di cellula/tessuto e allo stato metabolico. La conoscenza dettagliata della distribuzione degli enzimi regolatori di ciascuna via nei vari organi e nelle diverse situazioni fisiopatologiche è stata finora limitata dalla mancanza di saggi adeguati alla determinazione dell’attività di tali enzimi in estratti cellulari. In questo lavoro abbiamo sviluppato un saggio che consente la determinazione simultanea delle attività dei quattro enzimi regolatori in matrici biologiche di vario tipo. L’applicazione del saggio in estratti cellulari preparati da diversi organi di topo e linee cellulari umane ha confermato l’utilità del saggio per la ricostruzione del pathway biosintetico del NAD operativo nelle varie cellule. I risultati ottenuti in cellule di carcinoma ovarico hanno permesso di proporre una nuova strategia chemioterapica, basata sull’inibizione contemporanea delle due vie metaboliche che maggiormente contribuiscono al mantenimento dei livelli del coenzima in questo tipo di cellule. La terapia sperimentata su modelli di topo ha mostrato una significativa riduzione della crescita del tumore e un significativo aumento della sopravvivenza.