Yeast biotechnology for biofuels production

In the first part of this PhD thesis, Out of 10 Saccharomyces cerevisiae strains, three S. cerevisiae strains were evaluated in co-culture with S. stipitis CBS 5773 at different ratios using synthetic medium containing glucose and xylose. Bioreactor trials indicated that the optimal condition for ethanol production using S. cerevisiae EC1118 and S. stipitis co-culture was 1% of O2 concentration. To increase ethanol production with S. cerevisiae/S. stipitis co-culture a cell-recycle batch process was evaluated. Using this process, the maximum ethanol production (9.73 g/l) and ethanol yield (0.42 g/g) were achieved exhibiting a ten-fold increase in ethanol productivity in comparison with batch process (2.1 g/l/h). In these conditions a stabilization of the cells ratio S. cerevisiae/S. stipitis (1:5) at steady state condition was obtained. Dissolved oxygen concentration is crucial to achieve a proper co-culture ratio able to optimize second generation bioethanol production. In the second part of this PhD study, forty-seven Brettanomyces spp. strains were tested for cellobiose fermentation. Among these strains, twenty-eight Brettanomyces spp. strains gave a positive results, whilst twenty-one strains were faster in cellobiose fermentation. In order to detect the presence of β-glucosidase gene, a PCR was performed on thirteen Brettanomyces spp. strains (seven positive and six negative for cellobiose fermentation). Presence or absence of the gene was evaluated by agarose gel electrophoresis. The β-glucosidase gene is presented in all positive strains and four negative strains. The ethanol production and fermentation rate of the selected twenty-one Brettanomyces spp. strains (faster in cellobiose fermentation) were determined. Brettanomyces bruxellensis DiSVA FI10 (teleomorph Dekkera bruxellensis) and Brettanomyces anomalus DBVPG 6708 (teleomorph Dekkera anomala) strains were selected depending on the fermentation rate (five days) with high ethanol production. These strains were evaluated in co-culture with S. stipitis CBS 5773 at different ratios and different times of inoculation using synthetic medium containing glucose, xylose and cellobiose. The co-culture of B. anomalus DBVPG 6708 and S. stipitis achieved the best ethanol production (8.63 g/l) and ethanol yield (0.417 g/g). In the third part of this PhD study, nine Metschnikowia spp. strains and six Yarrowia lipolytica strains were tested for lipid production on raw glycerol. Metschnikowia sp. 271 and Y. lipolytica 347 were selected for biomass and lipid production and optimized using central composite factorial design (CCD) and Response Surface Methodology (RSM). The maximum lipid production (2.60 g/l) of Y. lipolytica 347 was maximized at C/N 118, time 144 h and 90 g/l of glycerol, while the maximum lipid production (0.49 g/l) of Metschnikowia sp. 271 was obtained in similar conditions but after a further incubation for 7 days at 16 °C. The fatty acids profile of Y. lipolytica exhibited a considerable amount of C18:1n7 (~36%), C18:1n9 (~16%), and C16:0 (~16%), whereas Metschnikowia sp. produced mainly C18:1n9 (~33%), C16:0 (~21%), and C16:1n7 (~21%). Both yeasts showed similar amounts of unsaturated fatty acids (~70%). However, remarkable amounts of polyunsaturated fatty acid (PUFAs) was only exhibited by Metschnikowia sp. (~12%). Both strains exhibited high amount of C16 and C18 fatty acids which indicates the potential use of this lipid for biodiesel production.

Nella prima parte di questa tesi di dottorato, Su 10 ceppi di Saccharomyces cerevisiae, tre ceppi di S. cerevisiae sono stati valutati in co-coltura con S. stipitis CBS 5773 a diversi rapporti utilizzando terreno sintetico contenente glucosio e xilosio. Prove in bioreattore hanno indicato che la condizione ottimale per la produzione di etanolo con S. cerevisiae EC1118 e S. stipitis co-coltura era 1% della concentrazione di O2. Per aumentare la produzione di etanolo da S. cerevisiae/S. stipitis co-coltura è stato valutato un processo batch con riciclo della biomassa. Utilizzando questo processo, è stata raggiunta la massima produzione di etanolo (9.73 g/l) con un rendimento in etanolo pari a 0.42 g/g, un aumento di produttività in etanolo di dieci volte se confrontato con il processo batch (2.1 g/l/h). In queste condizioni è stato ottenuto una stabilizzazione del rapporto cellulare S. cerevisiae/S. stipitis (1:5) in condizioni di stabilizzazione del processo. E' stato visto che la concentrazione di ossigeno disciolto è fondamentale per ottenere un corretto rapporto di co-coltura in grado di ottimizzare la produzione di bioetanolo di seconda generazione. Nella seconda parte di questo studio di dottorato, quarantasette ceppi di Brettanomyces spp. sono stati testati per la fermentazione del cellobiosio. Tra questi ventotto hanno dato un risultato positivo, mentre ventuno fermentavano rapidamente il cellobiosio. Al fine di rilevare la presenza del gene β-glucosidasi, una PCR è stata effettuata su tredici ceppi di Brettanomyces spp. (sette positivi e sei negativi per la fermentazione del cellobiosio). La presenza o assenza del gene è stata valutata mediante elettroforesi su gel di agarosio. Il gene β-glucosidasi è stato rilevato in tutti i ceppi positivi e in quattro tra i negativi. Sui ventuno ceppi di Brettanomyces spp. (fermentavano rapidamente il cellobiosio) è stato valutato il tasso di produzione dell'etanolo. Brettanomyces bruxellensis DiSVA FI10 (teleomorfo di Dekkera bruxellensis) e Brettanomyces anomalus DBVPG 6708 (teleomorfo di Dekkera anomala) sono stati selezionati in base ala velocità di fermentazione (cinque giorni), e alla produzione finale di etanolo. Questi ceppi sono stati valutati in co-coltura con S. stipitis CBS 5773 a diversi rapporti e tempi diversi di inoculo utilizzando mezzo sintetico contenente glucosio, xilosio e cellobiosio. La co-coltura di B. anomalus DBVPG 6708 e S. stipitis ha raggiunto la migliore produzione (8.63 g/l) e rendimento in etanolo (0.417 g/g). Nella terza parte di questo studio di dottorato, nove ceppi di Metschnikowia spp. e sei ceppi di Yarrowia lipolytica sono stati testati per la produzione di lipidi da glicerolo grezzo. Metschnikowia sp. 271 e Y. lipolytica 347 sono stati selezionati in funzione della produzione di biomassa e di lipidi. L'ottimizzazione è stata condotta utilizzando il disegno centrale composito fattoriale (CCD) e metodologia Response Surface (RSM). Per Y. lipolytica 347 il rapporto C/N 118, 144 h e 90 g/l di glicerolo sono risultate le migliori condizioni per la massima produzione di lipidi (2.60 g/l), mentre la massima produzione di lipidi (0.49 g/l) per Metschnikowia sp. 271 è stato ottenuta in condizioni simili ma dopo un ulteriore incubazione per 7 giorni a 16 °C. Il profilo degli acidi grassi di Y. lipolytica mostrato una considerevole quantità di C18:1n7 (~36%), C18:1n9 (~16%), e C16:0 (~16%), mentre Metschnikowia sp. la produzione di acidi grassi era la seguente: C18:1n9 (~33%), C16:0 (~21%), e C16:1n7 (~21%). Entrambi i lieviti hanno prodotto simili quantità di acidi grassi insaturi (~70%). Tuttavia, rilevanti quantità di acidi grassi polinsaturi (PUFAs) sono stati prodotti solo da Metschnikowia sp. (~12%). Entrambi i ceppi producono elevate quantità di acidi grassi C16 e C18 e possono essere utilizzati per la produzione di biodiesel.