Regeneration and genetic transformation: biotechnological approach to study genes controlling flowering differentiation in berry plant

The aim of work was to validate TERMINAL FLOWER 1 (TFL1), and FLOWERING LOCUS T (FTx ,) genes, in octoploid strawberry cultivars Calypso (everbearing) and Sveva (short day) in order to confirm hypotesis based on results achived in validation studies in diploid strawberry Fragaria vesca. Agrobacterium-mediated transformation technique was used to obtain transgenic lines of the different genes studied. Genes used in transformations trials were FvKSN and Fvksn, as control and with 2 bp deletion confering everbearing habits in diploid strawberry regarding TFL1 gene family, respectively. For FTx, floral activator FT1, FT2 and FT3 genes were used in order to understand their role in flowering pathways depending of the variety genotypes used, everbearing or short day. Preliminary regeneration tests were conducted and positive results was achived culturing Calypso cultivar in a medium supplemented with TDZ 0.5 mg L-1 and 0.02 mg L-1 of 2,4 D. while best regeneration efficiency was obtained culturing Sveva leaves in a medium supplemented with 3 mg L-1 of BA and 0.2 mg L-1 of IBA. Transformation trials were carried out and transgenic lines of Sveva FTx were obtained following and adopting protocol suggested by (Mezzetti, 2007) and currently updated during this activity (Cappelletti, 2014). Several adjusting were carried out regarding type of regeneration media and selection methods combining traditional antibiotics selection methods and green fluorescence protein (GFP) detecting and monitoring method in order to reduce chimaerism and escape plants, improve selection efficiency using two methods of stringent selection (iterative and non-iterative method). Parallel studies were carried out on blueberry regeneration techniques using different growth regulators (benzyladenine, thidiazuron and 2iP) and different regeneretion techniques: direct and indirect organogenesis using leaf and callus as starting material.

Lo scopo di questo lavoro è stato quello di avviare uno studio sul ruolo di geni appartenenti ai TERMINAL FLOWER 1 (TFL1), and FLOWERING LOCUS T (FTx ,) mediante il loro trasferimento con tecniche di ingegneria genetica in due cultivar ottoploidi di fragola, Calypso (rifiorente) a Sveva (giorno breve), così da confermare le ipotesi basate sui risultati ottenuti in studi di validazione genetica condotti nella fragola diploide Fragaria vesca (Koskela, 2012). Studi di rigenerazione preliminari sono stati effettuati così da mettere a punto il miglior substrato di rigenerazione delle cultivar di fragola impiegate per le prove di trasformazione. Per la cultivar Calypso è stato identificato come più efficiente il substrato MS addizionato con TDZ 0.5 mg L-1 e 0.02 mg L-1 of 2,4 D. Mentre per la cultivar Sveva risultati positive si sono ottenuti utilizzando il substrato MS addizionato con 3 mg L-1 of BA e 0.2 mg L-1 of IBA. Al fine di disporre protocolli utili anche per la trasformazione del mirtillo sono state realizzate anche prove di rigenerazione da tessuti fogliari di Duke, un nota cultivar di mirtillo. I risultati ottenuti hanno permesso di sviluppare due strategie di rigenerazione utilizzando diversi fitoregolatori (benziladenina, thidiazuron e 2iP) mediante due approcci di organogenesi diretta da foglia e indiretta da bulk meristematici. Per ogni approccio sono stati identificati i substrati più interessanti da utilizzare per la proliferazione di germogli (WPM + 2 mg L-1 di zeatina) e per la rigenerazione diretta WPM + Zeatina 2 mg L-1, indiretta 0.5 mg L-1. Sebbene siano stati ottenuti risultati interessanti ed applicabili anche per la trasformazione genetica del mirtillo, il lavoro è però continuato solo sulle cultivar di fragola. In fragola sono state condotte delle prove di trasformazione genetica utilizzando la tecnica di trasformazione mediata da Agrobacterium tumefaciens così da ottenere linee transgeniche da sottoporre ad analisi di espressione dei geni oggetto di studio. I geni utilizzati per gli esperimenti di trasformazione sono stati il FvKSN e il Fvksn, rispettivamente il controllo e il gene con una delezione di 2 pb responsabile del carattere di rifiorenza nella fragola diploide. Riguardo ai promotori della fioritura FTx i diversi FT1, FT2 e FT3, sono stati studiati con lo scopo di capire il ruolo nel “flowering pathways” della fragola ottoploide. Le prove di trasformazione hanno permesso di ottenere line transgeniche di Sveva FTx utilizzando il protocollo suggerito da Mezzetti et al., (2007) e ottimizzato con questo lavoro di tesi (Cappelletti, 2014). Variazioni sono state portate per quanto riguarda il substrato di rigenerazione e soprattutto riguardo il metodo di selezione combinando la tradizionale tecnica di selezione con antibiotico (iterative e non-iterativa) con un lavoro di individuazione e monitoraggio del segnale GFP (fluorescenza), così da rendere efficiente la selezione e ridurre la percentuale di chimere ed escape, molto elevata nelle prime prove condotte.