Adesine di Vibrio Cholerae: ruolo ecologico e nuove prospettive per lo sviluppo di vaccini

Cholera is a faecal-orally transmitted disease caused by Vibrio cholerae, a bacterium indigenous of coastal waters where it is found in the planktonic phase or associated with aquatic plants and animals. V. cholerae survival and diffusion in sea water and acquisition of virulence factors are strongly influenced by environmental variables, such as temperature, salinity, pH and plankton composition. In fact, V. cholerae efficiently binds to chitinaceous exoskeleton of zooplankton crustaceans (e.g., copepods) that represent the most important environmental reservoir for Vibrio bacteria. The knowledge of the environmental factors affecting V. cholerae ecology in the marine environment, and the molecular mechanisms involved in its interactions with aquatic substrates is crucial for the comprehension of V. cholerae transmission to humans. The first part of this study aimed at:  evaluating the influence of environmental variables such as temperature, pH and salinity on V. cholerae interactions with abiotic and biotic marine surfaces,  evaluating the specific role of each of the two most important ligands for chitin, GbpA (N-acetylglucosamine binding protein A, also involved in adhesion to intestinal epithelial cells) and MSHA (Mannose-sensitive haemagglutinin), in V. cholerae interactions with abiotic surfaces and zooplankters. Interactions with bivalves mollusks were also analyzed, being these organisms one of the most important vectors for transmission to humans in Western countries. In vitro assays have shown that the main environmental factor affecting V. cholerae association with chitin particles is temperature. In fact, the number of attached bacteria was 2.5 folds higher at 25°C compared to 5°C, and the expression of GbpA and MSHA encoding genes was 2.7 folds higher at 25°C compared to 15°C. In situ results, obtained performing monthly sampling over an annual cycle in a coastal area of the NW Mediterranean Sea, confirmed the role of temperature by showing that the percentage of vibrios attached to zooplankton increases dramatically at temperature values above 22°C. These findings, confirming the influence of temperature on V. cholerae persistence in sea water and copepod colonization, provide the first experimental evidence that temperature effect can be related to an enhanced expression of MSHA and GbpA adhesins. With regards to the study of V. cholerae interactions with aquatic organisms, binding properties of gbpA and mshA defective mutants, constructed by allelic exchange mutagenesis, were compared with those of their wild type strain. Adhesion assays were performed by using radiolabeled bacteria and evaluation of radioactivity associated to the substrates, and/or “green fluorescent protein” -tagged bacteria for scanning confocal microscopy analysis. The obtained results showed a lower association efficiency towards the tested substrates with both mutants in comparison to the wild type strain. This indicates that the two adhesins play a similar role in V. cholerae interactions with zooplankton and bivalve tissues. Interestingly, adherence to abiotic substrates (quartzite grains and polivinilchloride surfaces) was affected by MSHA ligand only, suggesting that MSHA binding properties are independent from target surface chemistry. On the other hand, GbpA ligand, whose receptor is N-acetylglucosamine, mediates adherence to surfaces containing this sugar, such as chitin (an N-acetylglucosamine polymer) and bivalve cells in sea water, and intestinal epithelial cells in humans. For the capability to mediate bacterial adherence in both the aquatic environment and humans, GbpA was named “dual role colonization factor”. The second part of this study was focused on GbpA adhesin, aiming at:  evaluating the diffusion of gbpA gene among V. cholerae and other Vibrio species,  studying the similarity of GbpA coding sequence in V. cholerae strains,  cloning gbpA gene in Escherichia coli and evaluating binding capabilities of the recombinant His-tagged GbpA protein (rGbpA-His). PCR-based detection showed that the gene was harboured by all the tested V. cholerae strains (n = 488), representative of a great diversity in serogroups, biotypes and sources. A high diffusion of the gene (96%) was detected even among Vibrio spp. isolates (n = 114). Phylogenetic analysis and multiple alignments of 38 GbpA amino acid sequences revealed that the gene is highly conserved within the V. cholerae species. The high diffusion of gbpA gene among vibrios, its highly conserved sequence, and the dual role played by GbpA ligand in both the aquatic environment and humans, make this adhesin a very interesting and promising candidate as component of a new anti-cholera vaccine. A prophylactic intervention based on GbpA would not only affect the success of the infection in humans but also the ecological fitness of the pathogen in its environmental reservoir. In this perspective, rGbpA-His protein was expressed in E. coli and purified by the use of affinity chromatography. The recombinant protein was then shown to maintain chitin-binding properties similar to those of the native ligand in V. cholerae. The rGbpA-His will be then used in further studies aimed at evaluating GbpA immunogenicity. In conclusion, this work shows that, by unravelling the ecology of Vibrio pathogens in the aquatic environment, new perspectives are gained towards improving current knowledge of the epidemiology of infectious diseases and development of new antimicrobial strategies.

Il colera è una patologia a trasmissione oro-fecale causata da Vibrio cholerae, un microorganismo indigeno delle acque costiere dove può trovarsi sia in forma planctonica che in associazione a piante e animali acquatici. La sopravvivenza e la diffusione di V. cholerae nelle acque e l’acquisizione di determinanti di virulenza sono fortemente influenzate da fattori quali temperatura, salinità, pH e, in particolare, dalla presenza di organismi dello zooplancton. Infatti, V. cholerae è in grado di aderire tenacemente all’esoscheletro chitinoso dei crostacei zooplanctonici e, soprattutto, dei copepodi che ne costituiscono il principale serbatoio ambientale. Lo studio dei fattori che influenzano l’ecologia di V. cholerae nelle acque e dei meccanismi molecolari alla base delle sue interazioni con i substrati presenti nel mare è, di conseguenza, di grande importanza per la comprensione della trasmissione all’uomo di questo patogeno. La prima fase di questo studio ha avuto come obiettivi principali:  la valutazione dell’influenza di fattori ambientali quali temperatura, pH e salinità sulle interazioni di V. cholerae con superfici biotiche e abiotiche dell’ambiente acquatico,  la valutazione del ruolo svolto da due importanti adesine batteriche leganti la chitina, GbpA (N-acetylglucosamine binding protein A, anche coinvolta nel legame alle cellule intestinali umane) e MSHA (Mannose-sensitive haemoagglutinin), nelle interazioni di V. cholerae con substrati inorganici ed organismi zooplanctonici. Le stesse adesine sono state studiate anche per il ruolo svolto nelle interazioni con i molluschi bivalvi che, nei paesi occidentali, rappresentano uno dei principali vettori di trasmissione dei vibrioni all’uomo. Saggi condotti in vitro hanno dimostrato che il più importante fattore ambientale in grado di influenzare l’associazione di V. cholerae con particelle di chitina è la temperatura che, ad esempio, variando da 5°C a 25°C, determina un incremento del numero di batteri adesi di 2.5 volte e, variando da 15°C a 25°C, induce un aumento dell’espressione dei geni gbpA e mshA di 2.7 volte. L’effetto della temperatura è stato confermato da studi in situ condotti nell’arco di un anno, mediante campionamenti mensili, nelle acque costiere del Mar Ligure. I risultati ottenuti hanno mostrato un aumento consistente della percentuale di vibrioni adesi allo zooplankton in corrispondenza di temperature superiori a 22°C. Questi risultati, oltre a confermare l’influenza della temperatura sulla colonizzazione dello zooplancton e, quindi, sulla persistenza dei vibrioni nelle acque, forniscono la prima evidenza sperimentale che tali effetti siano correlati all’espressione delle adesine GbpA e MSHA. Allo scopo di analizzare il ruolo svolto da GbpA e MSHA nelle interazioni di V. cholerae con organismi acquatici, le caratteristiche adesive dei due mutanti GbpA e MSHA difettivi, costruiti mediante mutagenesi per scambio allelico, sono state confrontate con quelle del ceppo parentale. I saggi di adesione sono stati condotti mediante marcatura dei batteri con isotopo radioattivo e quantificazione della radioattività associata al substrato, e/o marcatura con “green fluorescent protein” per l’osservazione al microscopio confocale a scansione. I risultati hanno dimostrato per entrambi i mutanti una riduzione, rispetto al ceppo parentale, dell’efficienza di adesione a tutti i substrati in esame, indicando per le due adesine un ruolo analogo nell’interazione di V. cholerae con lo zooplancton e i tessuti di mitilo. E’ interessante rilevare che solo il mutante difettivo per MSHA ha mostrato, rispetto al ceppo parentale, una riduzione nell’attacco a substrati inorganici (granuli di quarzite e superfici di polivinilcloruro). Questi risultati suggeriscono perciò che MSHA presenti proprietà adesive indipendenti dalla chimica della superficie di contatto. Al contrario, l’adesina GbpA, specificamente diretta verso l’N-acetilglucosamina, media l’adesione batterica a superfici contenenti tale zucchero tra cui, nel mare, la chitina (polimero di N-acetilglucosamina) e le membrane di cellule di mitilo e, nell’uomo, le cellule epiteliali intestinali. Per queste caratteristiche adesive che si manifestano sia nell’ambiente acquatico che nell’uomo, GbpA è stata definita “dual role colonization factor”. La seconda fase di questo studio è stata incentrata sull’adesina GbpA, con i seguenti obiettivi:  valutarne la diffusione in ceppi clinici e ambientali di V. cholerae e di altre specie di Vibrio,  compararne la sequenza genica in ceppi di V. cholerae,  clonarne il gene in Escherichia coli per costruire una proteina ricombinante marcata con tag di poly-His (rGbpA-His) di cui valutare le capacità adesive. I risultati ottenuti mediante PCR hanno dimostrato che il gene gbpA è presente in tutti i ceppi testati di V. cholerae (n = 488), di diversa origine, sierogruppo e biotipo, e nel 96% dei ceppi (n = 114) di altre specie di Vibrio. Dall’analisi filogenetica e dall’allineamento multiplo di 38 sequenze aminoacidiche di GbpA si è potuto constatare che il gene in esame è altamente conservato all’interno della specie V. cholerae. La diffusione del gene fra i vibrioni, la sequenza conservata e il doppio ruolo che l’adesina svolge nell’ambiente e nell’uomo, ne suggeriscono l’impiego per la preparazione di un nuovo vaccino contro il colera. L’uso della proteina GbpA per interventi di tipo profilattico potrebbe, infatti, presentare il vantaggio di combattere l’infezione nell’uomo e di agire sull’ecologia del patogeno nel suo ambiente naturale. La proteina rGbpA-His è stata quindi espressa in E. coli e purificata mediante cromatografia di affinità. Poiché le capacità adesive della proteina ricombinante così ottenuta sono risultate simili a quelle della proteina nativa di V. cholerae, rGbpA-His verrà utilizzata in studi successivi di valutazione dell’immunogenicità. Nel complesso, questa tesi evidenzia l’importanza dello studio dell’ecologia dei vibrioni patogeni nell’ambiente acquatico non solo per una migliore comprensione della loro trasmissione all’uomo ma anche per lo sviluppo di nuove strategie antimicrobiche.