Involvement of Inflammation and Activin A in Pathogenesis of Uterine Leiomyoma

Uterine leiomyomas (fibroids) are extremely common benign neoplasms. The incidence is over 60% in women of reproductive age and therefore represents one of the major public health problems. Leiomyomas are often multiple, originate in the smooth muscle layer of the uterus, and it has been proposed that each fibroid originates from a single transformed cell. Although the pathophysiology of leiomyomas is beginning to be understood their etiology still remains unknown. Over the last years, researchers have considered leiomyoma as a fibrotic disorder. Fibrosis is an exaggerated and continuous wound healing process triggered by tissue injury and characterized by excessive production of extracellular matrix (ECM) proteins, in particular collagens. Fibrosis is a mechanism that includes two main happenings: recruitment of inflammatory cells to the site of injury and activation of collagen producing cells- myofibroblasts. Our first study was morphological. We aimed to research: 1. If chronic inflammatory stimulus acting on the myometrium may trigger yet unidentified reparative cells to proliferate and to synthesize exaggerated amounts of ECM; 2. If leiomyoma myofibroblasts may derive from CD34-positive stromal fibroblasts. Our results showed the presence of a large number of inflammatory cells inside leiomyomas and in the surrounding tissue, when compared to autologous myometrium far from the leiomyoma. A large increase was observed in the amount of macrophages, identified by an antibody against CD68. Tissue macrophages are key cells in the reparative and scarring process, and in myofibroblasts recruitment and activation. Therefore, an increased number of inflammatory cells inside the leiomyoma support and agree with the hypothesis of an inflammatory pathogenesis of uterine leiomyoma. A second set of morphological results suggest the presence of myofibroblasts producing ECM in leiomyomas. The role of activin A in inflammatory pathways of different biological systems has been well documented. Since the level of Activin A is elevated during inflammation and is responsible for increase production of ECM in different pathological conditions. Therefore our aim was also to investigate if activin-A may have role in fibrosis process in uterus and leiomyoma development and growth, using an in vitro approach. We found that activin-A significantly increased fibronectin, collagen1A1 and versican mRNA expressions in primary leiomyoma cells, and it significantly increased fibronectin mRNA expressions but not collagen1A1 and versican expression in primary myometrial cells. The increased fibronectin expression by activin-A in leiomyoma cells was seen also at the protein level, by western blot and immunocytochemistry. Based on the findings that activin A has a pro-fibrotic role in uterine leiomyoma, we also evaluated whether and which inflammatory molecules are able to stimulate the expression of this profibrotic cytokine in leiomyoma and myometrial cells in vitro. We found in both, primary and immortalized cells, thatTNF-α was able to substantially increase activin A mRNA expression. To date, there is still no effective medical therapy against uterine leiomyomas. Hysterectomy, a permanent solution against leiomyomas, is a major abdominal surgical procedures caring on an increased risk of postoperative morbidity and leading to the loss of female reproductive potential. Tranilast is a synthetic drug that exhibits multiple therapeutic effects in diverse pathologic conditions. Since limited work has been reported in uterine fibroid biology, we aimed to research tranilast effect on ECM in leiomyoma. In the present study we demonstrated that tranilast has anti-fibrotic effect on human primary myometrial and leiomyoma cells. Overall, our research presents novel approach to leiomyoma pathogenesis. The presented data support the presence of inflammation inside the human uterine leiomyoma tissue, activation of collagen producing cells-myofibroblasts and the excessive production of ECM proteins, leading to the tissue remodeling and leiomyoma growth.

I leiomiomi (fibromi) uterini sono neoplasie benigne estremamente comuni. L’incidenza è di oltre il 60% in donne in età fertile e pertanto, rappresentano uno dei maggiori problemi di sanità pubblica. I leiomiomi sono spesso multipli, originano nello strato muscolare dell’utero, e si ritiene che ogni fibroma origina da una singola cellula trasformata. Sebbene si sta iniziando a comprende la patofisiologia dei leiomioma, la loro origine resta sconosciuta. Negli ultimi anni, i ricercatori hanno considerato i leiomiomi come una patologia fibrotica. La fibrosi è un processo continuo ed esagerato di guarigione innescato da danno tissutale ed è caratterizzata da eccessiva produzione di proteine della matrice extracellulare (ECM), in particolare collagene. La fibrosi è un meccanismo che include due eventi principali: reclutamento di cellule infiammatorie nel sito di lesione e l'attivazione di cellule – miofibroblasti - che producono collagene. La prima parte del nostro studio è stato condotta con un approccio morfologico. I nostri obiettivi erano di capire: 1. Se lo stimolo infiammatorio cronico che agisce sul miometrio può innescare, in cellule riparative ancora non identificate, la proliferare e la sintesi di quantità esagerate di ECM; 2. Se i miofibroblasti del leiomioma possono avere origine dai fibroblasti stromali CD34-positivi. I risultati ottenuti hanno mostrato la presenza di un gran numero di cellule infiammatorie all'interno del leiomioma e nel tessuto circostante, rispetto al miometrio autologo lontano dal leiomioma. Un forte aumento è stato osservato nella quantità di macrofagi, individuati da un anticorpo specifico per il CD68. I macrofagi tissutali sono cellule chiave nel processo riparativo e di cicatrizzazione, e nel processo di reclutamento e attivazione dei miofibroblasti. Pertanto, un aumento del numero di cellule infiammatorie nei leiomiomi è a favore e supporta l'ipotesi di una loro patogenesi di tipo infiammatoria. Una seconda serie di risultati morfologici suggeriscono la presenza, nei leiomiomi, di miofibroblasti che producono ECM. Il ruolo dell’activina A nel pathway infiammatorio è stato ampiamente documentato in diversi sistemi biologici. I livelli di activina A sono elevati durante l'infiammazione e l’activina A aumenta la produzione di ECM in diverse condizioni patologiche. Pertanto uno dei nostri scopi è stato anche quello di testare se l’activina-A può avere un ruolo nel processo di fibrosi uterina e nello sviluppo e crescita dei leiomioma, effettuando degli studi in vitro. Abbiamo visto che l’activina-A aumenta significativamente i livelli di mRNA della fibronectina, del collagene 1A1 e del versican nelle colture primarie di cellule di leiomioma, e ha aumentato in maniera significativa i livelli di mRNA della fibronectina ma non del collagene 1A1 e del versican in colture cellule primarie di cellule del miometrio. L'aumento della fibronectina indotto dall’activina-A nelle cellule di leiomioma è stato visto anche a livello proteico, mediante western blot e immunocitochimica. Considerato che l’activina A ha ruolo pro-fibrotico nei leiomioma uterini, abbiamo anche valutato se e quali molecole infiammatorie sono in grado di stimolare l'espressione di questa citochina profibrotica in vitro nelle cellule di leiomioma e di miometrio. Abbiamo trovato sia nelle cellule primarie che nelle linee cellulari che il TNF-α aumenta sostanzialmente i livelli di espressione di mRNA dell’activina. A tutt’oggi, non esiste ancora una terapia medica efficace contro i leiomiomi uterini. L’isterectomia, soluzione definitiva contro i leiomiomi, è uno dei principali interventi chirurgici addominali che determina un aumento del rischio di morbilità postoperatoria e che portano all’infertilità. Tranilast è una farmaco sintetico che presenta molteplici effetti terapeutici per diverse condizioni patologiche. Siccome non ci sono studi sui fibromi uterini, ci siamo chiesti se il tranilast avesse effetti sulle proteine della ECM nei leiomiomi. Nel presente studio abbiamo dimostrato che il tranilast ha un effetto anti-fibrotico sulle cellule primarie di miometrio e di leiomioma. Nel complesso, la nostra ricerca presenta un nuovo approccio per lo studio della patogenesi del leiomioma. I dati presentati supportano la presenza di infiammazione all’interno del fibroma uterino, l'attivazione di cellule produttrici di collagene-miofibroblasti e l'eccessiva produzione di proteine della ECM, che conducono al rimodellamento tissutale e alla crescita del leiomioma.