Probiotic administration as emerging biotechnology to improve the development, growth and metabolism of aquatic organism

Probiotics are defined by FAO and WHO as "live microorganisms which when administered in adequate amounts confer a health benefit on the host’". For this reason, in the last decades, probiotics gained popularity in both human medicine and aquaculture and mariculture field, as a potential bio-therapeutic in the treatment of many diseases and in order to improve the development of the organism. Numerous scientific studies conducted over the past decades showed that gut microbiota play an important role in maintaining the integrity of the intestinal tract and is also involved in the regulation of multiple host metabolic pathways. Recently, several studies have shown that an altered composition of the intestinal microbiota, characterized by reduction of beneficial bacteria and increase of pro-inflammatory bacteria and pathogens, may be implicated in the development of obesity, insulin resistance and diabetes, both in humans than in rodents; however, the mechanisms through which microbiota exerts its beneficial or harmful influences still remain objective of study. Several studies have shown the positive effects exerted by probiotics, which, due to their interaction with the intestinal microbiota and the intestinal cells and the production of metabolites resulting from their microbial activity, are able to control the energy homeostasis and to improve the well-being of the host. The present doctoral thesis, by using a multidisciplinary investigations, aspire to gain a further understanding on the effect of probiotic L. rhamnosus in zebrafish and the physiological effects of probiotic’s interaction with gut microbiota community and with different metabolic pathways which influence the physiology status, such as lipid, glucose and bone metabolism, and appetite control. Zebrafish (Danio rerio) has become a firmly established vertebrate model for many areas of biology and medicine. The most powerful resource in zebrafish is the accessibility of its complete genome sequence allowing the use of novel technologies, such as RNA-sequencing and genotyping platforms to study the molecular mechanisms involved in the organism’s response to nutrients. Recently, has been fully demonstrated the existence of shared synteny between human and zebrafish genomes as well as between zebrafish and aquacultured freshwater and marine fish species. To perform the first experiment, zebrafish embryos were collected from the same parents and were maintained in 3 L freshwater tanks at 26–28 °C. They were divided in control and treated groups. The control group was feed with commercial food, while the treated group was fed with commercial feed and with Lactobacillus rhamnosus 501 IMC 106 CFU ml-1 and samples were collected at 72 hpf (hatching), 96 hpf, 6 dpf, 8 dpf. Through a multidisciplinary approach it was possible to evaluate the effect of the probiotic L. rhamnosus on the intestinal microbiota and on the regulation of the pathways that control lipid metabolism, glucose and appetite. High-throughput sequence analysis of bacterial 16S rRNA V3 region performed on larvae at 6 dpf and 8 dpf evidenced a change in gut microbiota community exposed to the probiotic. L. rhamnosus administration was able to populate the gastrointestinal tract and to modulate the relative abundance of the microbial composition of the zebrafish larvae, specifically elevating the abundance of genus Firmicutes (predominantly lactobacilli and Streptococcus thermophilus) and reduced the relative abundance of Actinobacteria phylum (including potentially pathogenic Mycobacterium spp.), Proteobacteria phylum (in particular, Legionella, Plesiomonas and Pseudomonas) and Fusobacteria, Planctomycetes, Bacteroides phyla. The change in microbial community composition affected lipid metabolism, glucose metabolism and appetite through the modulation of genes involved in these pathways. With regard to the lipid metabolism, the results obtained by molecular analyses, showed a significant reduction of the expression level of genes fit2, agpat4 and dgat2, whose products are involved in the production of triglyceride and a significant increase of expression level of mgll, whose product is an enzyme involved in the hydrolysis of triglycerides. Moreover, the probiotic has significantly down-regulated the expression of hnf4α involved in the production of cholesterol. Finally, in probiotic larvae, has been observed a significant increase of cck gene expression, involved in the contraction of the gall bladder and in the release of bile which help the emulsification of fats. As for glucose metabolism, data showed that the probiotic treatment significantly increased the expression levels of nucb2 / nesftain-1 glp-1 and pre-pro-insulin transcripts, which are involved in the reduction of blood glucose level. Moreover, the data obtained have shown the ability of the probiotic to modulate appetite. In fact, data showed that the probiotic acts at transcriptional level by significantly up-regulating anorectic genes such as leptin and mc4r and significantly down-regulating orectic genes such as cb1, NPY and goat. In addition, the data obtained from high-performance liquid chromatography (HPLC) analysis performed on larvae at 6 dpf, reported a significant reduction of total body cholesterol and triglyceride content in probiotic treated larvae compared to the control. The fluorophores BODIPY 505/515 and BODIPY D3828, that respectively bind non-polar fatty acids and short chain fatty acids, allowed us to detect the remarkable presence of the non-polar fatty acid content in the gall bladder of 6 dpf treated larvae and the substantial presence of short chain fatty acids in both gallbladder and intestine of 8 dpf treated larvae. The images of intestine larvae at the stage of 6 dpf and 8 dfp, obtained by Transmission microscopy (TEM) revealed the ability of probiotics to change the architecture of the intestinal epithelium, in fact has been found a significant increase of microvilli and enterocyte lengths, thus increasing the intestinal absorptive surface area, and lastly, has been observed a significant reduction of lipid droplets size. In addition, administration of L. rhamnosus increased both total length and wet weight of zebrafish larvae; a significant increase of total length was registered in larvae at 8 dpf and a significant increase of wet weight was observed at 6 dpf and 8 dpf. To perform the second experiment, embryos were collected and divided into a control group, which was fed a commercial diet, and a probiotic-treated group, which received a commercial diet and L. rhamnosus IMC 501® at a concentration of 106 CFU and samples were collected at 9 hpf, 16 dpf, 23 dpf. Morphological and histochemical findings show that L. rhamnosus accelerates bone deposition through the up-regulation of the expression of key genes involved in ossification, such as runx2, sp7, mgp, gla and (bglap) as well as through down-regulation of sclerostin (sost), a bone formation inhibitor. Western blot analysis of mitogen-activated protein kinase 1 and 3-(Mapk1 and Mapk3), which are involved in osteoblast and osteocyte differentiation, documented an increase in Mapk1 16 days post fertilization (dpf) and of Mapk3 at 23 dpf in larvae treated with L. rhamnosus. In the third experiment, to test the hypolipidemic activity of Lactobacillus rhamnosus, zebrafish were feed with three different diets that vary in terms of lipid percentage (15%,10%, 5%). In each diet was added the probiotic L. rhamnosus, in order to obtained six different diets (15%, 10%, 5% and 15% + L. rhamnosus, L. rhamnosus + 10%, + 5% L. rhamnosus). All the groups were fed twice a day ad libitum for one month, then were sampled. Through a multidisciplinary study was possible to evaluate the hypolipidemic properties of the probiotic L. rhamnosus on zebrafish fed diets containing different percentage lipid and assess how the different lipid content in the diet affects the intestinal microbiota. The results obtained from the molecular analyses have demonstrated the ability of the probiotic to significantly modulate the expression levels of genes involved in the regulation of lipid metabolism and appetite. As regard to the lipid metabolism, data showed that the probiotic, in fish fed with 15%, 10% and 5%, induced significant reductions of hnf4α and npcl1a1 gene transcripts, the first involved in the production of cholesterol and the second involved in the cholesterol uptake by enterocytes. In addition, data showed that the probiotic, in fish fed with 15%, 10% and 5%, significantly up-regulated mgll gene transcript, involved in triglyceride breakdown and down-regulated fit2 gene transcript, involved in portioning triglycerides into lipid droplets. Moreover, L. rhamnosus, in fish fed with 15% and 10% of lipids, acts by significantly up-regulate expression level of anorectic genes such as nucb2/nesfatin-1, glp-1and pre-pro-insulin and by significantly down-regulate the orectic gene NPY, suggesting an important role of the probiotic in the control of the appetite. TEM images obtained from the intestines of zebrafish fed diets containing 15% and 10% lipids, have shown that an excessive lipid content in the diet induces a severe state of intestinal inflammation enhance the infiltration of granulocytes and macrophages populations in the intestinal epithelium. However, images of zebrafish intestines fed with the same diets (15% and 10%) probiotic-enriched, evidenced the reduction of granulocytes and macrophages, which allowed to highlight the capability of the probiotic to attenuate the inflammatory state in the intestine, caused by the high-fat diets. Finally, probiotic decrease of wet weight in fish fed with 15% and 10% lipid diets, while any significant differences were observed between group fed with 5% fish oil diets enriched or not with the probiotic. It has been also carried out high-throughput sequence and HPLC analysis, the first to evaluate the change of intestinal microbiota, the latter to establish the triglycerides and cholesterol contents in those fish which were fed with different lipid profile diets enriched or not with probiotic. The present doctoral thesis investigated the effects of the probiotic on gut microbiota community and the related physiological consequences on pathways involved in the regulation of lipid, glucose and bone metabolism as well as appetite control in zebrafish. Molecular results, together with metagenomics, biochemical and morphological data, allowed us to elucidate the mechanisms involved in the host physiological response followed by beneficial bacteria supplementation. Since in the last decades, the zebrafish has become an established vertebrate model for a wide range of human diseases with particular strengths for biomedical research , these analyses provide a list of candidate molecules through which the probiotic affect gut microbiota, gut architecture and host metabolism. The results here discussed could be important at different levels of the scientific approach: if on one side they represent a starting point for future studies on metabolism and could highlight a new potential role for the probiotic in the treatment of metabolic disorders, on the other hand they provide a useful insight to sustainable biotechnologies, applicable for a productivity increase in the aquaculture and mariculture industry.

I probiotici vengono definiti dalla FAO e dalla WHO come “organismi vivi che, se somministrati in quantità adeguata, apportano beneficio alla salute dell'ospite”. Per tale ragione, negli ultimi anni, essi sono stati ampiamente impiegati sia in campo biomedico sia in acquacoltura, come potenziali agenti bio-terapeutici nella cura di molte malattie e al fine di migliorare lo sviluppo dell’organismo allevato. Numerose ricerche scientifiche effettuate negli ultimi decenni hanno ampliato le conoscenze sulle funzioni dell’intestino, ponendo l’attenzione, in particolare, sul microbiota intestinale, la cui composizione e la cui attività influenzano le funzioni metaboliche e l’omeostasi dell’ospite. Pertanto, il microbiota intestinale è stato definito un vero e proprio organo metabolicamente attivo, molto importante per la salute dell’organismo. Recentemente, numerosi studi hanno messo in evidenza che una composizione alterata del microbiota intestinale, caratterizzata da riduzione di batteri benefici e aumento di batteri pro-infiammatori e patogeni, può essere implicata nello sviluppo di obesità, di resistenza all'insulina e di diabete, sia nell’uomo che nei roditori; tuttavia i meccanismi sottesi a tali disordini non sono ancora del tutto noti. I risultati finora ottenuti hanno evidenziato i numerosi effetti positivi esercitati dai probiotici, i quali, grazie alla loro interazione con il microbiota intestinale e con le cellule dell’intestino e alla produzione di metaboliti derivanti dalla loro attività microbica, sono in grado di controllare l’omeostasi energetica e di migliorare il benessere dell’ospite. La presente tesi di Dottorato è volta a determinare il ruolo del probiotico Lactobacillus rhamnosus IMC 501 nella regolazione di segnali coinvolti nel metabolismo lipidico, nel metabolismo del glucosio, nel metabolismo osseo e nell’appetito, attraverso la modulazione del microbiota intestinale, in zebrafish. Zebrafish (Danio rerio) è un modello ampiamente utilizzato in ambito biomedico grazie all’alta sintenia del suo genoma con quello umano, alla presenza di patologie che si incontrano anche nell’uomo e al completo sequenziamento del suo genoma; tali caratteristiche lo rendono un eccellente modello per lo studio della genetica e dello sviluppo, per la comprensione delle malattie umane e per lo screening di farmaci terapeutici. Nel primo esperimento, embrioni di zebrafish provenienti dagli stessi parentali sono stati raccolti e mantenuti in vasche da 3 L in condizioni controllate (26-28 °C, fotoperiodo 12/12 L/D). Gli embrioni sono stati divisi in due vasche, un gruppo controllo e un gruppo trattato. Il gruppo controllo è stato alimento solo con dieta commerciale, mentre il gruppo trattato è stato alimentato con dieta commerciale e Lactobacillus rhamnosus IMC 501 alla concentrazione di 106 CFU ml-1 e successivamente, da entrambi i gruppi sperimentali sono state campionate larve a diversi stadi di sviluppo partendo da: 72 hpf (hatching), 96 hpf (hour post fertilization), 6 dpf (days post fertilization), 8 dpf. Attraverso un approccio multidisciplinare è stato possibile valutare l’effetto del probiotico L. rhamnosus sul microbiota intestinale e sulla regolazione dei pathway che regolano metabolismo lipidico, glucidico e appetito. Analisi di high-throughput sequence della regione V3 del 16s rDNA batterico effettuate sulle larve a 6 dpf e 8 dpf, hanno messo in evidenza la capacità del probiotico di indurre cambiamenti nella composizione del microbiota intestinale. Infatti il probiotico ha determinato un aumento di specie benefiche appartenenti al phylum Firmicutes (prevalentemente lactobacilli and Streptococcus thermophilus) e ha ridotto l’abbondanza di specie potenzialmente patogene appartenenti al phylum Actinobacteria (in particolare Mycobacterium spp.), al phylum Proteobacteria (in particolare, Legionella, Plesiomonas and Pseudomonas) e ai phyla Fusobacteria, Planctomycetes, Bacteroides. I cambiamenti nella composizione del microbiota intestinale avvenuti in seguito alla somministrazione di L. rhamnosus, hanno indotto una modulazione a livello trascrizionale di geni coinvolti nella regolazione del metabolismo lipidico, glucidico e dell’appetito. In particolare, per quanto riguarda il metabolismo lipidico, i risultati ottenuti mediante analisi biomolecolari, hanno riportato una riduzione significativa dell’espressione dei geni fit2, agpat4 e dgat2, i cui prodotti sono coinvolti nella produzione di trigliceridi ed un aumento significativo dei livelli di espressione di mgll, il cui prodotto è un enzima coinvolto nell’idrolisi dei trigliceridi. Inoltre il probiotico ha ridotto significativamente i livelli di espressione di hnf4α coinvolto nella produzione del colesterolo. Infine, nelle larve trattate con probiotico, è stato registrato un significativo aumento dei livelli di espressione di cck, coinvolto nella contrazione della cistifellea e nel rilascio di bile, implicata nell’emulsificazione dei grassi. Per quanto concerne il metabolismo glucidico, i risultati ottenuti hanno evidenziato un aumento significativo dei livelli di espressione genica di nucb2/nesftain-1 glp-1 e pre-pro-insulin coinvolti nella riduzione del glucosio nel sangue. Inoltre, i dati ottenuti hanno messo in evidenza la capacità del probiotico di modulare l’appetito. Infatti, è stata riscontrata una riduzione significativa dei livelli di espressione di geni oressizzanti come cb1, npy e goat, e un aumento significativo dei livelli di espressione di geni anoressizzanti leptin e mc4r. In aggiunta, i dati ottenuti da analisi di cromatografia in fase liquida ad elevate prestazioni (HPLC), condotte su larve a 6 dpf, hanno messo in evidenza una diminuzione significativa del contenuto totale di trigliceridi e colesterolo nei trattati con probiotico rispetto al controllo. Grazie all’utilizzo dei fluorofori BODIPY 505/515 e BODIPY D3828, che mettono rispettivamente in evidenza acidi grassi non polari e acidi grassi a catena corta, è stato osservato, nelle larve a 6 dpf trattate con probiotico, un aumento significativo del contenuto di acidi grassi non polari nella cistifellea e, nelle larve a 8 dpf trattate con probiotico, un aumento di acidi grassi a catena corta, sia nella cistifellea che nell’intestino. Le immagini di intestini di larve allo stadio di sviluppo a 6 dpf e a 8 dpf ottenute al microscopio a trasmissione (TEM) hanno rilevato la capacità del probiotico di modificare l’architettura dell’epitelio intestinale; infatti è stato riscontrato un aumento significativo della lunghezza degli enterociti e dei microvilli, che ha determinato un incremento della superficie di assorbimento intestinale e una diminuzione della quantità di gocce lipidiche. In aggiunta, a 8 dpf è stato registrato un aumento significativo della lunghezza delle larve trattate con probiotico, mentre un incremento significativo del peso è stato rilevato sia a 6 dpf che 8 dpf. Nel secondo esperimento, embrioni di zebrafish sono stati divisi in due vasche, un gruppo controllo e un gruppo trattato. Il gruppo controllo è stato alimentato solo con dieta commerciale, mentre il gruppo trattato è stato alimentato con dieta commerciale e Lactobacillus rhamnosus IMC 501 alla concentrazione di 106 CFU ml-1 e, successivamente, da entrambi i gruppi sperimentali sono state campionate larve a diversi stadi di sviluppo, partendo da 9 dpf, 16 dpf, 23 dpf. I risultati morfologici ed istochimici hanno mostrato la capacità di L. rhamnosus di accelerare la formazione delle ossa attraverso un aumento significativo dell'espressione di geni chiave coinvolti nella ossificazione, come runx2, sp7, mgp, gla e bglap, e attraverso la riduzione significativa dei livelli di espressione del sost, inibitore della formazione dell’osso. I dati ottenuti mediante analisi di Western blott hanno messo in evidenza, nelle larve trattate con il probiotico, un aumento delle MAP-chinasi 1 e 3 (Mapk1 e Mapk3), coinvolte nella differenziazione di osteoblasti e di osteociti. In particolare, si è registrato un aumento significativo di Mapk1 a partire da 16 dpf e di Mapk3 a 23 dpf. Per condurre il terzo esperimento, sono state formulate diete contenti diverse percentuali di lipidi (15%, 10% e 5%). La dieta con il 15% di lipidi supera la quantità di grassi necessaria a soddisfare i requisiti energetici del pesce, mentre la dieta con il 10% di lipidi è isocalorica e fornisce la giusta quantità di lipidi necessari a soddisfare il fabbisogno energetico; la dieta con 5% di lipidi, infine, rappresenta una dieta ipocalorica con percentuale di lipidi minore rispetto a quella sufficiente a garantire il corretto fabbisogno energetico. Ad ogni dieta è stato aggiunto il probiotico L. rhamnosus, in questo modo sono state ottenute sei diete differenti (15%, 10%, 5% e 15% + L. rhamnosus, 10% + L. rhamnosus, 5% + L. rhamnosus). Adulti di zebrafish sono stati alimentati ad libitum due volte al giorno per un mese, quindi sono stati campionati. Attraverso uno studio multidisciplinare è stato possibile valutare le proprietà ipolipidemiche del probiotico L. rhamnosus su zebrafish alimentato con diete contenenti diversa percentuale lipidica, e valutare come il diverso contenuto lipidico nelle diete influenza il microbiota intestinale. I risultati ottenuti da analisi biomolecolari hanno dimostrato la capacità del probiotico di modulare significativamente i livelli di espressione di geni coinvolti nella regolazione del metabolismo lipidico e dell’appetito. Infatti, il probiotico, nei pesci alimentati con 15%, 10% e 5% di lipidi, ha indotto riduzioni significative a livello trascrizionale di hnf4α e npcl1a1, il primo coinvolto nella produzione di colesterolo e il secondo coinvolto nell’uptake di lipidi da parte degli enterociti. Inoltre, L. rhamnosus, nei pesci alimentati con il 15% e il 10% di lipidi, ha agito determinando un aumento significativo dei livelli di espressione di geni anoressigenici come nucb2/nesfatin-1, glp-1 e diminuendo significativamente il gene oressizante npy, suggerendo un ruolo importante del probiotico nel controllo dell’appetito. Immagini, ottenute al TEM, di intestini di zebrafish alimentati con diete contenenti il 15% e 10% di lipidi, hanno messo in evidenza che un eccessivo contenuto di lipidi nella dieta determina un grave stato di infiammazione intestinale che aumenta l’infiltrazione di popolazioni di granulociti e macrofagi nell’epitelio dell’intestino. Tuttavia, attraverso l’analisi di ulteriori immagini al TEM, relative ad intestini di zebrafish alimentati con le stesse diete (15% e 10%) arricchite con il probiotico, è stata evidenziata una minor presenza di granulociti e macrofagi, e ciò ha consentito di mettere in luce la capacità del probiotico di attenuare lo stato infiammatorio nell’intestino, causato dall’elevato contenuto di grassi nelle diete. Infine, è stata registrata una diminuzione significativa del peso di zebrafish alimentati con le diete contenti 15% e 10% di lipidi arricchite con il probiotico, rispetto ai gruppi alimentati con diete prive di probiotico, mentre il probiotico non ha determinato nessun effetto significativo sul peso di zebrafish alimentati con il 5% di lipidi. Sono state inoltre effettuate analisi high-throughput sequence e di HPLC, le prime al fine di valutare il cambiamento del microbiota intestinale, le seconde affinché possano essere valutate le differenze in contenuto di trigliceridi e colesterolo nei pesci i quali sono stati alimentati con diete a diverso profilo lipidico e ai quali è stato somministrato probiotico. I risultati ottenuti nella presente tesi di Dottorato contribuiscono a chiarire il ruolo svolto dai probiotici sul microbiota intestinale di zebrafish, mettendo in luce un nuovo network di geni attraverso il quale il probiotico espleta una funzione ipolipidemica e ipoglicemica e di riduzione dell’appetito, nonché di accelerazione della formazione delle ossa. I risultati qui descritti potrebbero avere validità scientifica diversa: se da un lato rappresentano un punto di partenza per futuri studi sul metabolismo e potrebbero evidenziare un nuovo ruolo potenziale per il probiotico nel trattamento di disturbi metabolici, dall'altro essi forniscono una visione utile per biotecnologie sostenibili, applicabili per un aumento della produttività del settore dell'acquacoltura e maricoltura.