Metagenomics has allowed the study of the diversity of organisms which can’t be cultivated and their role in various ecosystems, including soils and marine sediments, inland waters and the open ocean. The analysis of diversity through metagenomic approaches is based on the extraction of genomic DNA, assuming that it is completely associated with living biomass. However, recent studies have shown that the whole metagenome of each environmental sample is composed of different pools, including that of viruses, that associated with microbial biomass and that associated with non-living biomass (i.e, extracellular DNA). The procedures commonly used to isolate DNA from environmental samples do not discriminate between the various pools of DNA, thus affecting the results of investigations carried out. Viromes are metagenomes containing viral DNA. Viruses are not only the most abundant biological entities in the World’s oceans, but through their infection they control both prokaryotic abundance and diversity and important biogeochemical cycles of the marine ecosystem. The metagenomic approach applied to the viral component of marine systems has led to the discovery that viruses can be important agents of gene transfer: in fact, through recombination and integration viruses can either excide portions of the genomes of their hosts and transfer them to other hosts. Despite their importance, viral diversity in the deep-sea benthic ecosystems is still completely unknown and metagenomics seems to be the most effective approach to analyze it. So far, several bioinformatics tools were used to analyze viral sequences in environmental samples, but most of these tools have not been specifically designed for the analysis of viral sequences and comparisons to test for their validity do not exist or are too limited. In this study, we developed a specific procedure for the selective recovery of viral DNA from deepsea sediments. Viral DNA was sequenced, through pyrosequencing techniques, and analyzed comparing three annotation pipelines for metagenomic sequences (MG-RAST, VMGAP, MetaVir). To test their efficiency in the analysis of viral diversity we used both the sequencing data derived from viral metagenomes and those obtained in silico from sequences deposited in public databases. These analyses indicate that the taxonomic and functional diversity of viruses varies depending on the pipeline used. MetaVir proved to be the most reliable pipeline for the annotation of viral taxonomic diversity. However, since this pipeline was not designed for functional annotations of viral sequences, its results must necessarily be integrated with those obtained by other pipelines such as VMGAP. Therefore, this study highlights the need to develop a comprehensive bioinformatics platform for efficient functional and taxonomic annotation of viromes to shed light on the enormous genetic diversity contained in the viruses present in the largest ecosystem on Earth. The viral taxonomic diversity has been explored in marine sediment samples collected in different ocean areas of the globe, ranging from 2000 to 10000 m depth. The results of this analysis have revealed, for the first time, that viral diversity in benthic deep-sea ecosystems, is not only very high but also that some viral families are widespread, despite the environmental and ecological differences in the ecosystems analyzed. The similarity between the samples analyzed in this study and the majority of viromes published to date suggests that several factors contribute to shape the diversity of the viral assemblage. In addition, all viromes have a high functional diversity and also contain putative functions derived from their hosts, including key metabolic functions. The microbial metagenomes are made of DNA associated with living biomass and in deep-sea sediments they are mainly represented by prokaryotes (Bacteria and Archaea). The possibility of studying the microbial communities through metagenomic approaches has allowed us to better understand their role in the marine environment in deep marine environments, which are very difficult to reach, enabling the discovery of new enzymes and metabolic pathways, often useful for industrial or biotechnological applications. The extracellular DNA plays a key role in marine ecosystems, both as a source of nutrients and as a source of genes. It can be released from prokaryotic community during growth and through cell lysis (due to viral infection or to natural cell death). Sediments and soils can also preserve this released DNA, which can be adsorbed onto mineral and organic particles. This preserved extracellular pool can be incorporated into naturally-competent cells, which may undergo natural transformation processes. In this study, the contextual analysis of extracellular and microbial metagenomes in different benthic deep-sea ecosystems, has not only provided information on the specific composition of each pool, but also has revealed that the extracellular DNA contains a high genetic diversity, which to date has never been considered. This genetic diversity represents a major fraction of the genetic diversity associated with the whole metagenome. Most of the genetic diversity of the total DNA is represented by genes related to the extracellular DNA and, on average, about 50 % of the "species" contained in the extracellular DNA is shared with the microbiome. Moreover, the comparison among all the metagenomes showed that viral sequences are present not only in viromes, as expected, but also in microbiomes and extracellular metagenomes. The comparative bioinformatic analysis between all metagenomes has revealed the presence of putative functions involved in different processes of horizontal gene transfer. Of particular relevance are the functions for DNA uptake and mobilization and those related to mobile genetic elements, such as gene transfer agents (GTAs) and prophages. Laboratory experiments conducted in deep-sea sediments also show that the extracellular DNA may be an important genetic resource for the microbial community, since up to 6% of prokaryotic cells appear to be competent and able to acquire new functions. Taken together, these results suggest that deep benthic ecosystems have a high potential for gene transfer that can occur through multiple mechanisms.

La metagenomica ha permesso lo studio della diversità degli organismi non coltivabili e il loro ruolo nei vari ecosistemi tra cui suoli e sedimenti marini. acque interne e di oceano aperto. L’analisi della diversità attraverso gli approcci metagenomici è basata sull’estrazione del DNA genomico assumendo che questo sia completamente associato a biomassa vivente. Tuttavia, recenti studi hanno dimostrato che il metagenoma completo di ogni campione ambientale è costituito da pool differenti, tra cui: ,quello dei virus, quello associato a biomassa microbica e quello associato a biomassa non vivente (i.e., DNA extracellulare). Le procedure comunemente utilizzate per isolare il DNA da campioni ambientali non discriminano fra i diversi pool di DNA, influenzando quindi i risultati delle indagini effettuate. I viromi sono metagenomi contenenti DNA virale. I virus non sono solo le più abbondanti entità biologiche negli oceani del mondo, ma attraverso le loro infezioni controllano sia l'abbondanza e la diversità procariotica, sia cicli biogeochimici importanti a livello dell’ecosistema marino. L’approccio metagenomico applicato alla componente virale dei sistemi marini ha permesso di scoprire che i virus potenti possono essere importanti agenti di trasferimento genico: infatti , attraverso la ricombinazione e integrazione, i virus possono sia prelevare porzioni di genomi dei loro ospiti sia trasferirli ad altri ospiti. Nonostante la loro importanza, la diversità virale negli ecosistemi bentonici marini profondi è ancora del tutto sconosciuta e la metagenomica sembra essere l'approccio più efficace per analizzarla. Finora, diversi strumenti bioinformatici sono stati utilizzati per analizzare le sequenze virali in campioni ambientali, ma la maggior parte di questi strumenti non sono stati specificamente progettati per l'analisi delle sequenze virali e confronti per verificare la loro validità non esistono o sono troppo limitati. In questo studio abbiamo sviluppato una procedura specifica per il recupero selettivo del DNA virale da sedimenti marini profondi. Il DNA virale è stato sequenziato, attraverso tecniche di pirosequenziamento, e analizzato confrontando tre pipeline di annotazione di sequenze metagenomiche (MG-RAST, VMGAP, MetaVir). Questo al fine di testare la loro efficienza nell'analisi della diversità virale, sia utilizzando i dati di sequenziamento sia quelli derivanti da metagenomi virali ottenuti in silico a partire da sequenze depositate nelle banche dati. Queste analisi indicano che la diversità tassonomica e funzionale dei virus varia in funzione della pipeline utilizzata. MetaVir è risultata la pipeline più affidabile per l’annotazione tassonomica della diversità virale. Tuttavia, tale pipeline, non essendo stata progettata per annotazioni di tipo funzionale, deve essere necessariamente integrata con altre come VMGAP. Pertanto, questo studio evidenzia la necessità di sviluppare una piattaforma bioinformatica completa per un’annotazione efficiente sia tassonomica sia funzionale, al fine di .far luce sull'enorme diversità genetica contenuta nei virus presenti nel più grande ecosistema della Terra. La diversità tassonomica virale è stata esplorata in campioni di sedimento marino raccolti in differenti aree oceaniche del Globo, da 2000 a 10000 m di profondità. I risultati di questa analisi hanno permesso di evidenziare, per la prima volta, che la diversità virale negli ecosistemi bentonici profondi non solo è molto elevata, ma anche che alcune famiglie virali sono molto diffuse, nonostante le differenze ambientali ed ecologiche degli ecosistemi analizzati. Le similarità tra i campioni analizzati in questo studio e la maggior parte dei viromi ad oggi pubblicati suggeriscono che diversi fattori contribuiscono a modellare la diversità dell’assemblage virale. In aggiunta, tutti i viromi presentano un’elevata diversità funzionale putativa e contengono anche funzioni derivanti dai loro ospiti, tra cui funzioni metaboliche chiave. I metagenomi microbici sono costituiti da DNA associato a biomassa vivente, che nei sedimenti marini profondi è rappresentata prevalentemente da procarioti (Batteri e Archaea). La possibilità di studiare le comunità microbiche attraverso gli approcci metagenomici ha permesso di capire meglio il loro ruolo nell'ambiente marino anche negli ambienti marini profondi, che sono molto difficili da raggiungere, consentendo anche la scoperta di nuovi enzimi e vie metaboliche, spesso utili per applicazioni industriali o biotecnologiche. Il DNA extracellulare ha un ruolo chiave negli ecosistemi marini, sia come fonte di nutrienti che come fonte di geni. Può essere sia rilasciato dalla comunità procariotica durante la crescita sia attraverso la lisi cellulare (a causa di infezione virale o per morte cellulare naturale). Sedimenti e suoli possono anche preservare questo DNA rilasciato, che può rimanere adeso alle particelle minerali e organiche. Questo pool extracellulare conservato può essere incorporato da cellule naturalmente competenti, che possono andare incontro a processi di trasformazione naturale. In questo studio l'analisi contestuale dei metagenomi microbici ed extracellulari nei diversi ecosistemi bentonici profondi, non solo ha fornito informazioni riguardanti la composizione specifica di ciascun pool, ma ha anche rivelato che il DNA extracellulare contiene una diversità genetica elevata che ad oggi non era mai stata considerata. Tale diversità genetica costituisce una frazione rilevante della diversità genetica associata all’intero metagenoma. La maggior parte della diversità genetica del DNA totale è rappresentata da geni afferenti al DNA extracellulare e, in media, circa il 50% delle «specie» contenute nel DNA extracellulare è condiviso con il microbioma. Inoltre, dal confronto tra tutti i metagenomi risulta che sequenze virali sono presenti non solo, come atteso, nei viromi ma anche nei microbiomi e nei metagenomi extracellulari. L’analisi bioinformatica comparativa tra tutti i metagenomi ha rivelato la presenza di funzioni putative coinvolte in differenti processi di trasferimento genico orizzontale. Di particolare rilevanza sono le funzioni relative all’uptake del DNA e la sua mobilizzazione e quelle relative ad elementi genetici mobili come i gene transfer agents (GTAs) ed i profagi. Esperimenti di laboratorio condotti su sedimenti marini profondi dimostrano anche che il DNA extracellulare può essere una risorsa genetica importante per la comunità microbica dal momento che fino al 6% delle cellule procariotiche risultano essere competenti e in grado di acquisire nuove funzioni. Nel loro insieme, questi risultati suggeriscono che gli ecosistemi bentonici profondi hanno un elevato potenziale di trasferimento genico che può avvenire attraverso meccanismi multipli.

Microbial diversity and gene flow in deep-sea sediments / Tangherlini, Michael. - (2014 Feb 25).

Microbial diversity and gene flow in deep-sea sediments

Tangherlini, Michael
2014-02-25

Abstract

Metagenomics has allowed the study of the diversity of organisms which can’t be cultivated and their role in various ecosystems, including soils and marine sediments, inland waters and the open ocean. The analysis of diversity through metagenomic approaches is based on the extraction of genomic DNA, assuming that it is completely associated with living biomass. However, recent studies have shown that the whole metagenome of each environmental sample is composed of different pools, including that of viruses, that associated with microbial biomass and that associated with non-living biomass (i.e, extracellular DNA). The procedures commonly used to isolate DNA from environmental samples do not discriminate between the various pools of DNA, thus affecting the results of investigations carried out. Viromes are metagenomes containing viral DNA. Viruses are not only the most abundant biological entities in the World’s oceans, but through their infection they control both prokaryotic abundance and diversity and important biogeochemical cycles of the marine ecosystem. The metagenomic approach applied to the viral component of marine systems has led to the discovery that viruses can be important agents of gene transfer: in fact, through recombination and integration viruses can either excide portions of the genomes of their hosts and transfer them to other hosts. Despite their importance, viral diversity in the deep-sea benthic ecosystems is still completely unknown and metagenomics seems to be the most effective approach to analyze it. So far, several bioinformatics tools were used to analyze viral sequences in environmental samples, but most of these tools have not been specifically designed for the analysis of viral sequences and comparisons to test for their validity do not exist or are too limited. In this study, we developed a specific procedure for the selective recovery of viral DNA from deepsea sediments. Viral DNA was sequenced, through pyrosequencing techniques, and analyzed comparing three annotation pipelines for metagenomic sequences (MG-RAST, VMGAP, MetaVir). To test their efficiency in the analysis of viral diversity we used both the sequencing data derived from viral metagenomes and those obtained in silico from sequences deposited in public databases. These analyses indicate that the taxonomic and functional diversity of viruses varies depending on the pipeline used. MetaVir proved to be the most reliable pipeline for the annotation of viral taxonomic diversity. However, since this pipeline was not designed for functional annotations of viral sequences, its results must necessarily be integrated with those obtained by other pipelines such as VMGAP. Therefore, this study highlights the need to develop a comprehensive bioinformatics platform for efficient functional and taxonomic annotation of viromes to shed light on the enormous genetic diversity contained in the viruses present in the largest ecosystem on Earth. The viral taxonomic diversity has been explored in marine sediment samples collected in different ocean areas of the globe, ranging from 2000 to 10000 m depth. The results of this analysis have revealed, for the first time, that viral diversity in benthic deep-sea ecosystems, is not only very high but also that some viral families are widespread, despite the environmental and ecological differences in the ecosystems analyzed. The similarity between the samples analyzed in this study and the majority of viromes published to date suggests that several factors contribute to shape the diversity of the viral assemblage. In addition, all viromes have a high functional diversity and also contain putative functions derived from their hosts, including key metabolic functions. The microbial metagenomes are made of DNA associated with living biomass and in deep-sea sediments they are mainly represented by prokaryotes (Bacteria and Archaea). The possibility of studying the microbial communities through metagenomic approaches has allowed us to better understand their role in the marine environment in deep marine environments, which are very difficult to reach, enabling the discovery of new enzymes and metabolic pathways, often useful for industrial or biotechnological applications. The extracellular DNA plays a key role in marine ecosystems, both as a source of nutrients and as a source of genes. It can be released from prokaryotic community during growth and through cell lysis (due to viral infection or to natural cell death). Sediments and soils can also preserve this released DNA, which can be adsorbed onto mineral and organic particles. This preserved extracellular pool can be incorporated into naturally-competent cells, which may undergo natural transformation processes. In this study, the contextual analysis of extracellular and microbial metagenomes in different benthic deep-sea ecosystems, has not only provided information on the specific composition of each pool, but also has revealed that the extracellular DNA contains a high genetic diversity, which to date has never been considered. This genetic diversity represents a major fraction of the genetic diversity associated with the whole metagenome. Most of the genetic diversity of the total DNA is represented by genes related to the extracellular DNA and, on average, about 50 % of the "species" contained in the extracellular DNA is shared with the microbiome. Moreover, the comparison among all the metagenomes showed that viral sequences are present not only in viromes, as expected, but also in microbiomes and extracellular metagenomes. The comparative bioinformatic analysis between all metagenomes has revealed the presence of putative functions involved in different processes of horizontal gene transfer. Of particular relevance are the functions for DNA uptake and mobilization and those related to mobile genetic elements, such as gene transfer agents (GTAs) and prophages. Laboratory experiments conducted in deep-sea sediments also show that the extracellular DNA may be an important genetic resource for the microbial community, since up to 6% of prokaryotic cells appear to be competent and able to acquire new functions. Taken together, these results suggest that deep benthic ecosystems have a high potential for gene transfer that can occur through multiple mechanisms.
25-feb-2014
La metagenomica ha permesso lo studio della diversità degli organismi non coltivabili e il loro ruolo nei vari ecosistemi tra cui suoli e sedimenti marini. acque interne e di oceano aperto. L’analisi della diversità attraverso gli approcci metagenomici è basata sull’estrazione del DNA genomico assumendo che questo sia completamente associato a biomassa vivente. Tuttavia, recenti studi hanno dimostrato che il metagenoma completo di ogni campione ambientale è costituito da pool differenti, tra cui: ,quello dei virus, quello associato a biomassa microbica e quello associato a biomassa non vivente (i.e., DNA extracellulare). Le procedure comunemente utilizzate per isolare il DNA da campioni ambientali non discriminano fra i diversi pool di DNA, influenzando quindi i risultati delle indagini effettuate. I viromi sono metagenomi contenenti DNA virale. I virus non sono solo le più abbondanti entità biologiche negli oceani del mondo, ma attraverso le loro infezioni controllano sia l'abbondanza e la diversità procariotica, sia cicli biogeochimici importanti a livello dell’ecosistema marino. L’approccio metagenomico applicato alla componente virale dei sistemi marini ha permesso di scoprire che i virus potenti possono essere importanti agenti di trasferimento genico: infatti , attraverso la ricombinazione e integrazione, i virus possono sia prelevare porzioni di genomi dei loro ospiti sia trasferirli ad altri ospiti. Nonostante la loro importanza, la diversità virale negli ecosistemi bentonici marini profondi è ancora del tutto sconosciuta e la metagenomica sembra essere l'approccio più efficace per analizzarla. Finora, diversi strumenti bioinformatici sono stati utilizzati per analizzare le sequenze virali in campioni ambientali, ma la maggior parte di questi strumenti non sono stati specificamente progettati per l'analisi delle sequenze virali e confronti per verificare la loro validità non esistono o sono troppo limitati. In questo studio abbiamo sviluppato una procedura specifica per il recupero selettivo del DNA virale da sedimenti marini profondi. Il DNA virale è stato sequenziato, attraverso tecniche di pirosequenziamento, e analizzato confrontando tre pipeline di annotazione di sequenze metagenomiche (MG-RAST, VMGAP, MetaVir). Questo al fine di testare la loro efficienza nell'analisi della diversità virale, sia utilizzando i dati di sequenziamento sia quelli derivanti da metagenomi virali ottenuti in silico a partire da sequenze depositate nelle banche dati. Queste analisi indicano che la diversità tassonomica e funzionale dei virus varia in funzione della pipeline utilizzata. MetaVir è risultata la pipeline più affidabile per l’annotazione tassonomica della diversità virale. Tuttavia, tale pipeline, non essendo stata progettata per annotazioni di tipo funzionale, deve essere necessariamente integrata con altre come VMGAP. Pertanto, questo studio evidenzia la necessità di sviluppare una piattaforma bioinformatica completa per un’annotazione efficiente sia tassonomica sia funzionale, al fine di .far luce sull'enorme diversità genetica contenuta nei virus presenti nel più grande ecosistema della Terra. La diversità tassonomica virale è stata esplorata in campioni di sedimento marino raccolti in differenti aree oceaniche del Globo, da 2000 a 10000 m di profondità. I risultati di questa analisi hanno permesso di evidenziare, per la prima volta, che la diversità virale negli ecosistemi bentonici profondi non solo è molto elevata, ma anche che alcune famiglie virali sono molto diffuse, nonostante le differenze ambientali ed ecologiche degli ecosistemi analizzati. Le similarità tra i campioni analizzati in questo studio e la maggior parte dei viromi ad oggi pubblicati suggeriscono che diversi fattori contribuiscono a modellare la diversità dell’assemblage virale. In aggiunta, tutti i viromi presentano un’elevata diversità funzionale putativa e contengono anche funzioni derivanti dai loro ospiti, tra cui funzioni metaboliche chiave. I metagenomi microbici sono costituiti da DNA associato a biomassa vivente, che nei sedimenti marini profondi è rappresentata prevalentemente da procarioti (Batteri e Archaea). La possibilità di studiare le comunità microbiche attraverso gli approcci metagenomici ha permesso di capire meglio il loro ruolo nell'ambiente marino anche negli ambienti marini profondi, che sono molto difficili da raggiungere, consentendo anche la scoperta di nuovi enzimi e vie metaboliche, spesso utili per applicazioni industriali o biotecnologiche. Il DNA extracellulare ha un ruolo chiave negli ecosistemi marini, sia come fonte di nutrienti che come fonte di geni. Può essere sia rilasciato dalla comunità procariotica durante la crescita sia attraverso la lisi cellulare (a causa di infezione virale o per morte cellulare naturale). Sedimenti e suoli possono anche preservare questo DNA rilasciato, che può rimanere adeso alle particelle minerali e organiche. Questo pool extracellulare conservato può essere incorporato da cellule naturalmente competenti, che possono andare incontro a processi di trasformazione naturale. In questo studio l'analisi contestuale dei metagenomi microbici ed extracellulari nei diversi ecosistemi bentonici profondi, non solo ha fornito informazioni riguardanti la composizione specifica di ciascun pool, ma ha anche rivelato che il DNA extracellulare contiene una diversità genetica elevata che ad oggi non era mai stata considerata. Tale diversità genetica costituisce una frazione rilevante della diversità genetica associata all’intero metagenoma. La maggior parte della diversità genetica del DNA totale è rappresentata da geni afferenti al DNA extracellulare e, in media, circa il 50% delle «specie» contenute nel DNA extracellulare è condiviso con il microbioma. Inoltre, dal confronto tra tutti i metagenomi risulta che sequenze virali sono presenti non solo, come atteso, nei viromi ma anche nei microbiomi e nei metagenomi extracellulari. L’analisi bioinformatica comparativa tra tutti i metagenomi ha rivelato la presenza di funzioni putative coinvolte in differenti processi di trasferimento genico orizzontale. Di particolare rilevanza sono le funzioni relative all’uptake del DNA e la sua mobilizzazione e quelle relative ad elementi genetici mobili come i gene transfer agents (GTAs) ed i profagi. Esperimenti di laboratorio condotti su sedimenti marini profondi dimostrano anche che il DNA extracellulare può essere una risorsa genetica importante per la comunità microbica dal momento che fino al 6% delle cellule procariotiche risultano essere competenti e in grado di acquisire nuove funzioni. Nel loro insieme, questi risultati suggeriscono che gli ecosistemi bentonici profondi hanno un elevato potenziale di trasferimento genico che può avvenire attraverso meccanismi multipli.
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