Studio degli intermedi deamidati del NAD e del loro metabolismo

Nicotinamide, also known as niacinamide, is the amide of nicotinic acid (vitamin B3/ niacin) better known as PP Vitamin (Pellagra-Preventive). His lack in feeding leads to pellagra, a skin disease with skin manifestations and peculiar injuries. Nicotinamide deamidase has been one of the enzymes object of this work. In a previous work the enzyme with NDasic activity from rabbit’s liver has been purified until to obtain an homogeneous preparation, its aminoacidic sequence has shown to be a Carboxylesterase (CES family). CES are responsible for the metabolism of numerous endogenous and exogenous compounds. Furthermore, It was demonstrated that they can hydrolize aromatic amides. In this research project, we confirmed that CES from mammalian can hydrolyze Nam to Na, using commercial enzyme from rabbit and porcine’s liver. Kinetic studies of these enzymes has shown very high Km values for Nam as substrate, suggesting that the enzyme hasn’t a relevant physiological activity. The next step was to study if the human CES has NDasic activity. We tried to obtain the human protein using eukaryotic expression systems such as mammalian cells, COS-7. We did investigate a way to obtain a sufficient amount of protein necessary for the planned studies. To detect the activity of human CE, it was necessary to use an high concentration of nicotinamide (100 mM). The high Km value indicates a not significant physiological activity, suggesting the hypothesis that in mammalian, the way of deamidation from Nam to Na is absent. In the second part of the work, we have started to develop an assay to determine the activities of the enzymes with a key role in the NAD synthesis pathway. This assay uses bacterial enzymes as coupled system, which convert NMN and NaMN to NaAD. NaAD is then revealed in a fluorimetric cycling assay. It has been develop an assay for the sensitive determination of mononucleotides NMN and NaMN with good results, although it should be further improved.

La Nam è l’amide della Vitamina B3 meglio conosciuta come Vitamina PP (Pellagra-Preventive). La sua mancanza nell’alimentazione porta alla pellagra, una malattia della pelle con manifestazioni cutanee e lesioni ben distinte. Uno degli enzimi oggetto del presente lavoro è la nicotinamide deamidasi. In un precedente lavoro è stato purificato ad omogeneità l’enzima dotato di attività NDasica da fegato di coniglio; la sequenza di tale enzima ha rilevato che si trattava in realtà della CES. Le CES sono enzimi che svolgono un ruolo importante nel metabolismo e nella detossificazione di numerosi composti endogeni e xenobiotici. E’ stato rilevato inoltre che possono svolgere anche un’attività deamidasica nei confronti di ammidi aromatiche. In questo progetto di ricerca, abbiamo confermato che la CES da mammifero è in grado di deamidare la Nam ad Na, usando preparazioni commerciali di esterasi di fegato di coniglio e di maiale. Lo studio della cinetica di queste due preparazioni enzimatiche nei confronti della Nam, tuttavia, ha mostrato dei valori di Km molto alti, il che ci farebbe escludere un possibile ruolo fisiologico dell’enzima. L’obiettivo successivo è stato quello di valutare se anche la CES umana fosse dotata di attività NDasica. É stata tentata l’espressione della proteina in sistemi di espressione eucariotici quali le cellule di mammifero COS-7. Tuttavia, non è stata ottenuta una quantità sufficiente di proteina idonea agli studi necessari. Per rilevare l’attività deamidasica della CE umana è stata utilizzata un’alta concentrazione di Nam(100 mM). L’alto valore di Km indica un’attività deamidasica non significativa da un punto di vista fisiologico, a sostegno dell’ ipotesi che nei mammiferi, la via di deamidazione della Nam a Na è assente. Nella seconda parte del lavoro di tesi, è stato iniziato lo sviluppo di un saggio per la determinazione delle attività degli enzimi chiave delle vie di sintesi del NAD, sia l’amidata sia la deamidata. Si tratta di un saggio che fa uso di enzimi ancillari di origine batterica che convertono i prodotti delle reazioni catalizzate dagli enzimi di interesse (NMN e NaMN) in NaAD. Quest’ultimo viene poi valutato mediante un saggio ciclico fluorimetrico. La messa a punto del saggio, che prevede l’ottimizzazione della procedura per la quantizzazione dei mononucleotidi NaMN e NMN, ha dato buoni risultati, anche se va ulteriormente affinata.