Role of yeast bioactive compounds in food and fermented beverages

In recent years, the bioactive compounds with antimicrobial activity such as yeast killer toxins, bacteriocins and natural antifungal agents are employed to reduce or inhibit the growth and the development of undesired fungi, yeasts or bacteria. Their use was proposed in alternative or in combination to the addition of synthetic antimicrobial agent in food and fermented beverage. The present research focused on the antimicrobial role and the characterization of bioactive molecules produced by yeast strains belonging to Metschnikowia pulcherrima, Tetrapisispora phaffii, Kluyveromyces wickerhamii, Wickerhamomyces anomalus species. Following a characterization of the antimicrobial compounds produced by these yeasts and investigating on the interaction between natural antimicrobial molecules and sensitive yeasts/moulds, the present study focused the attention on their use to combat contaminating microorganisms in “organic” agriculture and in wine industry. In the first part of the present thesis seven different strains of M. pulcherrima were screened to evaluate the growth inhibition of the main oenological yeasts such as Pichia, Candida, Hanseniaspora, Kluyveromyces, Saccharomycodes, Torulaspora, Brettanomyces and Saccharomyces involved in winemaking process. The effective antagonistic actions of M. pulcherrima strains was showed on undesired wild spoilage yeasts, such as the Pichia, Brettanomyces and Hanseniaspora genera, while Saccharomyces cerevisiae was not affected by the antimicrobial action of M. pulcherrima. The objective of the second part of this study was the isolation of the gene encoding Kpkt, a killer toxin produced by Tetrapisispora phaffii. The gene disruption caused a complete loss of the killer phenotype thus confirming that TpBgl2p exerts an effective killer activity and that the gene is effectively involved in the expression of the zymocin. The result obtained gives the basis to explore the heterologous production of the protein that could be used as starter in enological field to reduce wine contamination. In the third part of the thesis, the attention was focused on the damage induced by Kwkt and Pikt killer proteins, produced by Kluyveromyces wickerhamii and Wickerhamomyces anomalus, involved in the biocontrol of Brettanomyces/ Dekkera spoilage yeast in the wine industry. The effect of mycocins was also compared with sulfur dioxide, generally used as antiseptic in food and beverage industries. The results showed different mechanisms of control of B. bruxellensis growth within the two mycocins. Different mechanisms of action were also found between killer toxins and sulfur dioxide that is strongly influenced by pH. In the fourth part of this work it was evaluated the interaction between several yeasts that exhibit antimicrobial activity and some filamentous fungi that generally colonize mature fruits. Preliminarily, a plate screening was performed to assess inhibitory effect of 42 yeasts against 5 moulds, main spoilage microorganisms in vegetables and fruits during postharvest. In a second step, ten selected strains were tested for their effective inhibitory activity against moulds in vivo assay on grapes, lemons, oranges, strawberries and cherries. Results indicated that the best antagonistic activity was exhibited by Wickerhamomyces anomalus and Metschnikowia pulcherrima species that produced a significant reduction of moulds.

Negli ultimi anni le molecole bioattive con attività antimicrobica come tossine killer, batteriocine e agenti antifungini sono state impiegate per ridurre o inibire la crescita e lo sviluppo di funghi, lieviti e batteri indesiderati in alternativa o in combinazione con i composti sintetici antimicrobici negli alimenti e nelle bevande fermentate. La presente ricerca riguarda il ruolo e la caratterizzazione di molecole bioattive prodotte da lieviti appartenenti alle specie Metschnikowia pulcherrima, Tetrapisispora phaffii, Kluyveromyces wickerhamii, Wickerhamomyces anomalus. Dopo la caratterizzazione dei composti bioattivi prodotti da questi lieviti e lo studio dell'interazione tra le molecole antimicrobiche naturali e i lieviti/ le muffe sensibili, abbiamo voluto valutare il loro possibile impiego per combattere microrganismi contaminanti nell’agricoltura biologica e nel settore vinicolo. Nella prima parte della tesi è stata valutata l’azione inibente di sette ceppi di M. pulcherrima nei confronti di lieviti enologici principalmente coinvolti nel processo di vinificazione come Pichia, Candida, Hanseniaspora, Kluyveromyces, Saccharomycodes, Torulaspora, Brettanomyces e Saccharomyces. Un’efficace azione antagonista dei ceppi di M. pulcherrima è stata osservata nei confronti di lieviti indesiderati appartenenti ai generi Pichia, Brettanomyces e Hanseniaspora, mentre tale attività antimicrobica non si evidenziava nei confronti di Saccharomyces cerevisiae. Il secondo argomento trattato ha riguardato l’isolamento del gene che codifica Kpkt, la tossina killer prodotta da Tetrapisispora phaffii che possiede un’ampia attività antimicrobica nei confronti di vari lieviti alterativi del vino. La distruzione del gene ha provocato una perdita completa del fenotipo killer confermando così che TpBgl2p esercita un'attività antimicrobica. Il risultato ottenuto è la base per valutare la possibilità di esplorare la produzione eterologa della proteina che potrebbe essere utilizzata in campo enologico per ridurre le contaminazioni nel vino in sostituzione della SO2. Nella terza parte della tesi, l’attenzione è stata focalizzata sul danno indotto dalle tossine Kwkt and Pikt, prodotte rispettivamente da Kluyveromyces wickerhamii e Wickerhamomyces anomalus, coinvolte nel biocontrollo dei lieviti spoilage Brettanomyces/ Dekkera in vinificazione. L’effetto delle micocine è stato comparato con quello dell’anidride solforosa, generalmente usata come composto sintetico antimicrobico negli alimenti e nelle bevande fermentate. I risultati hanno mostrato diversi meccanismi di controllo della crescita di B. bruxellensis tra le due tossine e tra le tossine killer e il biossido di zolfo, anche se l'attività antimicrobica di quest’ultimo è fortemente influenzata dal fattore pH. Nella quarta parte della tesi è stata valutata l'interazione tra diversi lieviti ad attività antimicrobica e alcuni funghi filamentosi che in genere colonizzano i frutti maturi. Preliminarmente è stato eseguito uno screening in piastra per valutare l’eventuale effetto inibente di 42 lieviti verso 5 muffe, che causano i principali danni in frutta e verdura durante il periodo di post-raccolta. In una seconda fase, dieci ceppi selezionati sono stati testati per la loro attività inibitoria efficace contro le muffe in test in vivo su uva, limoni, arance, fragole e ciliegie. I risultati indicano che, tra i ceppi saggiati la migliore e interessante attività antagonista nei confronti delle muffe testate, è stata mostrata da due ceppi appartenenti a Wickerhamomyces anomalus e Metschnikowia pulcherrima.