Structural and functional characterization of human alfa1-acid glycoprotein

a1-Acid glycoprotein (AGP) is an important member of the acute phase response involved in drug binding and modulation of the immune system. AGP belongs to the lipocalin superfamily, a wide group of ubiquitous proteins sharing a strikingly conserved b-barrel fold that serves as a binding site for a large number of hydrophobic molecules. Investigation of the temperature-induced denaturation pathway at neutral pH has lead to the discovery of a molten globule state, an important intermediate in the folding of many, if not most, proteins. Fourier-Transform infrared (FT-IR) spectroscopy has been extensively used in the investigation of AGP due to its sensitivity towards fluctuations within protein structures. A survey of several environmental conditions, including pH and disulfide redox state, has shown that the temperature-induced molten globule state only forms at neutral or slightly acidic pH values. Strongly acidic or reducing environments induce concomitant denaturation and aggregation of the polypeptide chain following increases in temperature. Further research has been undertaken to characterize AGP aggregates obtained in the absence or presence of the disulfide-specific reducing agent TCEP. Binding of the dyes Congo red and Thioflavin T indicates that the aggregates possess a cross-b motif, suggesting that they are amyloid in nature. Upon observation by transmission electron microscopy, the fibrils formed under reducing conditions appeared to be more abundant and longer than those formed under non-reducing conditions, and possessed a high degree of branching and bending. Molecular Dynamics simulations revealed that under reducing conditions, a long C-terminal loop, lining one side of the b-barrel, displays increased flexibility and leads to exposure of aggregation-prone regions that are normally buried in the native fold.

Lo studio delle propriet`a strutturali e funzionali della a1-glicoproteina acida, nota anche come orosomucoide o, dall’acronimo inglese, AGP, costituisce l’oggetto di questa tesi. La AGP rappresenta, dopo l’albumina, la pi `u abbondante proteina nel plasma dei mammiferi, con concentrazioni fisiologiche comprese tra 0,5 e 1,5 mg/mL. Essa appartiene alla famiglia delle lipocaline, un ampio gruppo di proteine ubiquitarie accomunate da una struttura centrale a barile b (b-barrel) che funge da sito di legame per un elevato numero di molecole idrofobiche. Studi precedenti hanno evidenziato la presenza di un molten globule, un importante intermedio di folding nei processi di denaturazione (e rinaturazione) di molte proteine. `E stata condotta un’analisi di ampio respiro riguardante numerosi fatto ambientali (pH, stato ossidoriduttivo, temperatura), la quale ha mostrato come intermedi strutturali di tipo molten globule si formino solo in condizioni di pH neutri o debolmente acidi. Valori di pH fortemente acidi, cos`ı come condizioni riducenti, inducono la concomitante denaturazione e aggregazione delle catene polipeptidiche in seguito all’aumento di temperatura. Un’ulteriore linea di ricerca portata avanti durante il dottorato ha riguardato la caratterizzazione di forme aggregate dell’AGP ottenute in specifiche condizioni di pH, temperatura e stato ossidativo dei ponti disolfurici. La capacit`a di legare Congo rosso e Tioflavina T indica che tali forme aggregate sono di natura amiloide. Simulazioni di dinamica molecolare hanno mostrato come, in seguito alla riduzione dei ponti disolfurici, la coda posta al C-terminale della AGP risulti dotata di elevata flessibilit`a, permettendo l’esposizione al solvente di zone ad alto potenziale fibrillogenico normalmente protette nel fold nativo della proteina.