Protein S-glutathionylation: new insights on pre-oncogenic cellular model and formulation of a new molecular mechanism

Protein S-glutathionylation is an important post-translational modification which allows to protect cysteine residues against irreversible oxidation during redox imbalance and to affect proteins changes in structure, activity or sub-cellular localization. Modifications in S-glutathionylation are been associated with a number of human pathologies, such as diabetes, cardiovascular, lung and neurodegenerative diseases and cancer. Aims of this work were 1) to investigate possible links between this post-translational modification and oncogene-induced senescence in oncogenic H-Ras expressing cells, and 2) to discover a new possible catalyst of glutathionylation. H-Ras oncogene requires deregulation of additional oncogenes or inactivation of tumor suppressor proteins to increase cell proliferation rate and completely transform cells. Indeed, the expression of the constitutively activated H-RasV12 induces cell growth arrest and premature senescence, which act like barriers in pre-neoplastic lesions. H-RasV12 transfected cells showed a dramatic modification of morphology and premature senescence followed by cell death induced by autophagy and apoptosis. This phenotype is induced mainly by the PI3K and MAPK pathways. Moreover, it was provided evidence that the premature senescence is associated with cellular redox imbalance (due to a strong reduction of total antioxidant capacity and significant decrease of glutathione levels) as well as with altered S-glutathionylation. Different proteins S-glutathionylation patterns were observed in control and H-RasV12 expressing cells. Particularly, three proteins were identified by mass spectrometry: vimentin, ATP synthase β-subunit and α-enolase. So, antioxidant defense reduction, glutathione depletion and subsequent modification of S-glutathionylation of target proteins contribute to arrest cell growth, leading to death of fibroblasts expressing constitutively active H-Ras oncogene, thus acting as oncogenic barriers that obstacle the progression of cell transformation. Mechanisms of protein S-glutathionylation are far to be completely understood and several reactions can promote it, either spontaneously or catalyzed. To date, three potential catalysts of protein glutathionylation are been proposed, however, other enzymes may be implicated in this type of catalysis. In this work, it was studied glyoxalase II as a new potential candidate to promote S-glutathionylation. To demonstrate its active involvement in protein glutathionylation were used purified proteins known to be glutathionylated for in vitro experiments. For the first time this work shows active involvement of cytosolyc glyoxalase II for in vitro protein Sglutathionylation, suggesting a new mechanism of protein-SSG formation. Glyoxalase II, indeed, allows a rapid and specific protein-SSG formation, allowing enzymatic regulation of S-glutathionylation in proteins of different origin and cellular compartmentalization.

La glutationilazione proteica è un importante modifica post-traduzionale che permette sia di proteggere i residui di cisteina delle proteine dall'ossidazione irreversibile che può verificarsi durante lo sbilanciamento redox cellulare, sia di influenzare cambiamenti nella struttura, nell'attività o nella localizzazione sub-cellulare delle proteine. Modificazioni della S-glutationilazione a carico delle proteine sono state associate con una serie di patologie umane, quali diabete, malattie cardiovascolari e polmonari, malattie neurodegenerative e cancro. Data l'importanza della glutationilazione, obiettivi di questo lavoro sono stati 1) indagare i possibili legami tra glutationilazione e senescenza oncogene-indotta in cellule che esprimono H-Ras e 2) scoprire un nuovo possibile catalizzatore della glutationilazione prendendo in considerazione un enzima con caratteristiche adeguate al ruolo. L’ oncogene H-Ras richiede la deregolazione di altri oncogeni o l’inattivazione di proteine tumore-soppressore per aumentare la velocità di proliferazione cellulare e trasformare completamente le cellule. Infatti, l'espressione di H-RasV12 costitutivamente attivato induce arresto della crescita cellulare e senescenza prematura, che agiscono come barriere oncogeniche nelle lesioni pre-neoplastiche. Le cellule trasfettate con H-RasV12 hanno mostrato una drammatica modificazione della morfologia e senescenza prematura seguita da morte cellulare indotta da autofagia e apoptosi. Questo fenotipo è indotto principalmente dalle vie PI3K e MAPK. È stato dimostrato che la senescenza prematura è associata con uno squilibrio redox cellulare e con un’alterata S-glutationilazione. Infatti, è stato osservato un diverso pattern di proteine glutationilate tra le cellule controllo e quelle esprimenti H-RasV12. In particolare, sono state identificate mediante spettrometria di massa tre proteine: vimentina, ATP sintasi subunità-β ed α-enolasi. In conclusione, la riduzione della difesa antiossidante, la deplezione di glutatione e la successiva S-glutationilazione di proteine bersaglio possono contribuire ad arrestare la crescita cellulare, portando alla morte dei fibroblasti esprimenti l’oncogene H-Ras costitutivamente attivato ed agendo quindi come barriera oncogenica che ostacola la progressione della trasformazione cellulare. I meccanismi di S-glutationilazione proteica sono lontani dall’essere completamente compresi in quanto diverse reazioni possono promuovere questa reazione, sia spontaneamente sia tramite catalizzatori. Ad oggi tre potenziali catalizzatori di glutationilazione proteica sono stati proposti, tuttavia, altri enzimi possono essere implicati in questo tipo di catalisi. In questo lavoro, è stata studiata la gliossalasi II come nuovo candidato potenziale per promuovere la S-glutationilazione. Per dimostrare la sua partecipazione attiva nella glutationilazione di proteine sono state utilizzate proteine purificate notoriamente glutathionilate per effettuare esperimenti in vitro. Per la prima volta è stato dimostrato il coinvolgimento della gliossalasi II nella Sglutationilazione di proteine, suggerendo un nuovo meccanismo per la formazione di addotti proteina-SSG. La gliossalasi II, infatti, permette una rapida e specifica formazione di proteina-SSG, consentendo la regolazione enzimatica della Sglutationilazione in proteine di diversa origine e compartimentalizzazione cellulare.