Localizzazione cellulare e sinpatica di GAT-1 e GAT-3 nella corteccia cerebrale di ratto

In the present work has been carefully studied the distribution and localization of GABA transporters, GAT-1 and GAT-3 in the rat cerebral cortex, in order to extend the current knowledge about their expression, by studying systematically the distribution of sub-cellular, synaptic organization and synaptic levels of GAT-1 and GAT-3 in the brain cortex by pre and post-embedding electron microscopy techniques and threedimensional high resolution confocal microscopy. In general, pre-embedding studies have revealed a complex localization of both transporters. Although GAT-1 is mainly neuronal, is also widely expressed in glial processes, while GAT-3 is predominantly glial and only a small fraction is also present in neurons. The expression of GAT-1, and not of GAT-3, is polarized in the cortical synapses. At the synaptic level, GAT-1 is predominantly expressed in axon terminals of symmetrical synapses including several glial processes, although a non-negligible part of GAT-1 is present at the level of asymmetric synapses (glial processes in perisynaptic and postsynaptic dendrites). In contrast GAT-3, at the synaptic level, is more expressed in the perisynaptic processes and is equally distributed between symmetric and asymmetric synapses. Post-embedding studies show that the expression of GAT-1 in GABAergic synapses is approximately in 60% of cases in terminals, in 29% only in peri-synaptic astrocytes and 11% in both segments. While in the case of GAT-3, is in 78% of perisynaptic astrocytes, 13% in terminals and 8% in both. Also, in axon terminals GAT-1 is distributed in the peri-synaptic and extra-synaptic area, while in the astrocytic processes is present more in the extra-synaptic area. As regards GAT-3, in astrocytic processes is more concentrated in extra-synaptic area, while in the terminals is scattered, without forming a real agglomeration. 2 Finally, GAT-1 and GAT-3 levels at GABA-ergic synapses were estimated by 3D quantitative confocal microscopy applied to VGAT positive terminals: estimated levels indicated that at GABA-ergic synapses GAT-1 expression was significantly higher (~1.5 times) than that of GAT-3. In conclusion, results on the expression and localization of GAT-1 and GAT-3 in GABA-ergic synapses, allow on the one hand to elucidate the role of the two transporters in the regulation of both phasic and tonic transmission, on the other hand to suggest the possibility of a functional duality of GAT-1 (determined by the adjustment of the levels of GABA in synaptic and extra-synaptic sites), while GAT-3 would show a single functional activity (regulation of GABA levels in the extrasynaptic sites).

Nel presente lavoro è stata finemente studiata la distribuzione e la localizzazione dei trasportatori del GABA, GAT-1 e GAT-3 nella corteccia cerebrale di ratto, al fine di estendere le attuali conoscenze riguardo la loro espressione. A tale scopo sono stati studiati sistematicamente la distribuzione sub-cellulare, l’organizzazione sinaptica e i livelli sinaptici di GAT-1 e GAT-3 nella corteccia cerebrale mediante microscopia elettronica con tecniche di pre- e post-embedding e microscopia confocale tridimensionale ad alta risoluzione. In generale gli studi di pre-embedding hanno permesso di evidenziare una complessa localizzazione di entrambi i trasportatori GAT-1 e GAT-3. Sebbene GAT-1 sia principalmente neuronale, è largamente espresso anche nei processi gliali, mentre GAT-3 è prevalentemente gliale e solo una piccola frazione è presente anche nei neuroni. L’espressione di GAT-1, e non di GAT-3, è polarizzata nelle sinapsi corticali. A livello sinaptico, GAT-1 è prevalentemente espresso nei terminali assonici di sinapsi simmetriche compresi diversi processi gliali, seppure una frazione non trascurabile di GAT-1 sia presente anche a livello di sinapsi asimmetriche (nei processi gliali perisinaptici e dendriti postsinaptici). Al contrario GAT-3, a livello sinaptico, è maggiormente espresso nei processi perisinaptici ed è equamente distribuito tra sinapsi simmetriche e asimmetriche. Gli studi di post-embedding dimostrano che l’espressione di GAT-1 nelle sinapsi GABAergiche è all’incirca nel 60% dei casi nei terminali, nel 29% nei soli astrociti perisinaptici e nell’11% in entrambi i comparti. Mentre nel caso di GAT-3 è nel 78% negli astrociti perisinaptici, 13% nei terminali e 8% in entrambi. Inoltre nei terminali assonici, GAT-1 è distribuito nell’area peri-sinaptica ed extrasinaptica, mentre nei processi astrocitari è presente maggiormente nella zona extrasinaptica. Per quanto 2 riguarda GAT-3, nei processi astrocitari è maggiormente concentrato nell’area extrasinaptica, mentre nei terminali è sparso, senza formare un vero e proprio agglomerato. Infine, i livelli di GAT-1 e GAT-3 nelle sinapsi GABAergicche sono stati stimati attraverso microscopia confocale-3D ad alta risoluzione applicata ai terminali VGAT: a livello delle sinapsi GABAergiche, GAT-1 è significativamente più espresso (~1,5 volte) rispetto a GAT-3. In conclusione, i risultati sull’espressione e sulla fine localizzazione di GAT-1 e GAT-3 nelle sinapsi GABAergiche, consentono da un lato di elucidare il ruolo dei due trasportatori nella regolazione dei fenomeni sia fasici che tonici del GABA e dall'altro di suggerire la possibilità di un dualismo funzionale di GAT-1 (determinato dalla regolazione dei livelli di GABA nei siti sinaptici ed extrasinaptici), mentre GAT-3 mostrerebbe una singola attività funzionale (regolazione dei livelli di GABA nei siti extrasinaptici).