AIMS: The introduction in clinical practice of CCR5 antagonists as a new class of entry inhibitors has determined the need to know the coreceptor usage before starting therapy. Most clinicians obtain this information through the Trofile assay, that in the last version is characterized by enhanced sensitivity (ESTA). The widespread use of this assay is impractical for the high cost and the long turnaround time. Several attempts have been made to achieve faster, cheaper and reliable results by improving genotypic interpretation algorithms. However, because of the high variability of the env region, genotypic assays can still be unreliable, while phenotypic biological assays are almost always capable of defining the actual tropism. A simple and sensitive recombinant phenotypic assay would still prove useful: the goal of the paper was to compare an in-house HIV recombinant phenotypic assay to ESTA and both phenotypic assays to the performances of a genotypic HIV-1 tropism prediction algorithm. METHODS: Recombinant DNA techniques were used to introduce a blunt-end cloning cassette in the replicating HIV-NL4-3 molecular clone in order to clone different V3 sequences from patient virus in the replicative backbone for phenotypic testing. A GFP reporter (engineered as a nef fusion product in the backbone) allowed viral replication to be determined by fluorimetric analysis of CCR5 or CXCR4 expressing cell lines following transfection. Virtual phenotype was obtained by V3-loop RNA genotype-based geno2pheno (G2P) interpretation setting false positive rate (FPR) at 10%. RESULTS: 117 recombinant viruses were obtained from plasma samples of 38 HIV-1 patients. Coreceptor usage was analyzed in all recombinant clones indicating R5 tropism in 90 and DM/X4 tropism in 20 clones corresponding to 28 and 9 patients respectively, not reportable (NR) phenotype was observed in all viral chimerae obtained from 1 of the 38 patients. ESTA was determined in all 38 patients indicating R5 in 25, DM/X4 in 9 and NR in 4. On the whole, there was correspondence between the two biological assays, and between G2P prediction and ESTA. Some discrepancy was observed comparing G2P prediction of the molecular clones and their coreceptor usage CONCLUSIONS: The recombinant phenotypic assay described is highly comparable to ESTA moreover it offers the possibility to dissect the composite phenotype of viral quasispecie at the clonal level providing information about the influence of specific aminoacidic residue. Interestingly, 33% of V3 clonal sequences, predicted as probable X4 by virtual algoritm, conferred an R5 tropism when inserted into NL4-3. The threshold level of FPR should be considered with great attention.

OBIETTIVI: L’introduzione nella pratica clinica degli antagonisti del CCR5 come nuova classe di inibitori dell’entry ha determinato la necessità di conoscere il coreceptor usage del virus prima di iniziare la terapia. Molti clinici ottengono questa informazione utilizzando il test Trofile nell’ ultima versione ultrasensibile (ESTA).Il largo utilizzo di questo saggio è limitato da alti costi e da lunghi tempi di attesa per la risposta. Sono perciò stati fatti numerosi sforzi per ottenere risultati in minor tempo possibile e con bassi costi migliorando i test genotipici che prevedono l’utilizzo di algoritmi interpretativi. A causa dell’elevata variabilità del gene env i saggi genotipici sono tuttavia inaffidabili mentre i saggi biologici sono quasi sempre in grado di definire il tropismo attuale. A tal fine abbiamo messo a punto un vettore di espressione fluorescente che si caratterizza per consentire il clonaggio delle sequenze V3 amplificate dal paziente di interesse. Questo plasmide è dotato di un gene per la proteina fluorescente GFP che viene espressa quando il virus replica nelle cellule, è pertanto possibile conoscere sia il fenotipo conferito da quella specifica sequenza V3 che la capacità replicativa della variante V3 attraverso l’analisi fluorimetrica delle cellule dopo un saggio di transfezionne-infezione. Obiettivo di questo lavoro è confrontare il saggio fenotipico home-brew con il saggio commerciale Trofile nella sua forma più sensibile l’Enhanced Trofile (ESTA) e conseguire una valutazione comparativa tra i diversi saggi fenotipici e tra i saggi fenotipici e saggi virtuali nella definizione del coreceptor usage. MATERIALI E METODI: E’ stata utilizzata una strategia molecolare ricombinante che ha permesso di clonare in pNLmodΔV3GFP la sequenza V3 amplificata dal virus di 38 pazienti analizzati generando chimere virali replicative. La regione V3 delle varianti virali è stata sequenziata e analizzata al geno2pheno, al fine di ottenere la predizione del fenotipo. E’ importante determinare il livello di significatività, cioè di selezionare quanto conservativa è la determinazione del virus X4, questo livello di significatività è determinato dal tasso di falsa positività per la classificazione di un virus X4. Questo tasso detto FPR (False Positive Rate) è un cut off, una soglia al di sopra della quale i virus sono definiti R5 e al di sotto X4. Attualmente l’FPR utilizzato dalla comunità scientifica è del 10%; questo valore sembra raggiungere un buon compromesso tra sensibilità e specificità. RISULTATI: sono stati ottenuti 117 cloni dal plasma di 38 pazienti HIV-1 positivi, il saggio ricombinante home brew ha identificato 90 cloni con fenotipo R5 corrispondenti a 28 pazienti, 20 cloni con fenotipo D/M corrispondenti a 9 pazienti e tutte le chimere virali ottenute da 1 paziente sono risultate essere non replicative (risultato DM con ESTA). Il saggio ESTA ha identificato 25 pazienti con fenotipo R5, 9 pazienti con fenotipo D/M e 4 NR (due di questi sono risultai D/M e uno R5 con il nostro saggio). CONCLUSIONI: il saggio fenotipico home brew descritto si mostra più sensibile del saggio ESTA ed inoltre offre la possibilità di analizzare la quasi specie virale del paziente consentendo di studiare l’influenza che ogni residuo aminoacidico della regione V3 ha sul fenotipo. I nostri risultati mostrano che il 33% delle sequenze V3 clonate identificate come X4 dall’algoritmo geno2pheno quando inserite nel backbone di NL 4-3 conferiscono alla chimera virale un fenotipo R5. Il livello di FPR dovrebbe pertanto essere scelto con molta attenzione.

Identificazione del corecettore utilizzato da HIV per l'ingresso nella cellula: confronto tra saggio fenotipico in vitro e fenotipo virtuale

Monachetti, Alessia
2012-02-24

Abstract

OBIETTIVI: L’introduzione nella pratica clinica degli antagonisti del CCR5 come nuova classe di inibitori dell’entry ha determinato la necessità di conoscere il coreceptor usage del virus prima di iniziare la terapia. Molti clinici ottengono questa informazione utilizzando il test Trofile nell’ ultima versione ultrasensibile (ESTA).Il largo utilizzo di questo saggio è limitato da alti costi e da lunghi tempi di attesa per la risposta. Sono perciò stati fatti numerosi sforzi per ottenere risultati in minor tempo possibile e con bassi costi migliorando i test genotipici che prevedono l’utilizzo di algoritmi interpretativi. A causa dell’elevata variabilità del gene env i saggi genotipici sono tuttavia inaffidabili mentre i saggi biologici sono quasi sempre in grado di definire il tropismo attuale. A tal fine abbiamo messo a punto un vettore di espressione fluorescente che si caratterizza per consentire il clonaggio delle sequenze V3 amplificate dal paziente di interesse. Questo plasmide è dotato di un gene per la proteina fluorescente GFP che viene espressa quando il virus replica nelle cellule, è pertanto possibile conoscere sia il fenotipo conferito da quella specifica sequenza V3 che la capacità replicativa della variante V3 attraverso l’analisi fluorimetrica delle cellule dopo un saggio di transfezionne-infezione. Obiettivo di questo lavoro è confrontare il saggio fenotipico home-brew con il saggio commerciale Trofile nella sua forma più sensibile l’Enhanced Trofile (ESTA) e conseguire una valutazione comparativa tra i diversi saggi fenotipici e tra i saggi fenotipici e saggi virtuali nella definizione del coreceptor usage. MATERIALI E METODI: E’ stata utilizzata una strategia molecolare ricombinante che ha permesso di clonare in pNLmodΔV3GFP la sequenza V3 amplificata dal virus di 38 pazienti analizzati generando chimere virali replicative. La regione V3 delle varianti virali è stata sequenziata e analizzata al geno2pheno, al fine di ottenere la predizione del fenotipo. E’ importante determinare il livello di significatività, cioè di selezionare quanto conservativa è la determinazione del virus X4, questo livello di significatività è determinato dal tasso di falsa positività per la classificazione di un virus X4. Questo tasso detto FPR (False Positive Rate) è un cut off, una soglia al di sopra della quale i virus sono definiti R5 e al di sotto X4. Attualmente l’FPR utilizzato dalla comunità scientifica è del 10%; questo valore sembra raggiungere un buon compromesso tra sensibilità e specificità. RISULTATI: sono stati ottenuti 117 cloni dal plasma di 38 pazienti HIV-1 positivi, il saggio ricombinante home brew ha identificato 90 cloni con fenotipo R5 corrispondenti a 28 pazienti, 20 cloni con fenotipo D/M corrispondenti a 9 pazienti e tutte le chimere virali ottenute da 1 paziente sono risultate essere non replicative (risultato DM con ESTA). Il saggio ESTA ha identificato 25 pazienti con fenotipo R5, 9 pazienti con fenotipo D/M e 4 NR (due di questi sono risultai D/M e uno R5 con il nostro saggio). CONCLUSIONI: il saggio fenotipico home brew descritto si mostra più sensibile del saggio ESTA ed inoltre offre la possibilità di analizzare la quasi specie virale del paziente consentendo di studiare l’influenza che ogni residuo aminoacidico della regione V3 ha sul fenotipo. I nostri risultati mostrano che il 33% delle sequenze V3 clonate identificate come X4 dall’algoritmo geno2pheno quando inserite nel backbone di NL 4-3 conferiscono alla chimera virale un fenotipo R5. Il livello di FPR dovrebbe pertanto essere scelto con molta attenzione.
24-feb-2012
AIMS: The introduction in clinical practice of CCR5 antagonists as a new class of entry inhibitors has determined the need to know the coreceptor usage before starting therapy. Most clinicians obtain this information through the Trofile assay, that in the last version is characterized by enhanced sensitivity (ESTA). The widespread use of this assay is impractical for the high cost and the long turnaround time. Several attempts have been made to achieve faster, cheaper and reliable results by improving genotypic interpretation algorithms. However, because of the high variability of the env region, genotypic assays can still be unreliable, while phenotypic biological assays are almost always capable of defining the actual tropism. A simple and sensitive recombinant phenotypic assay would still prove useful: the goal of the paper was to compare an in-house HIV recombinant phenotypic assay to ESTA and both phenotypic assays to the performances of a genotypic HIV-1 tropism prediction algorithm. METHODS: Recombinant DNA techniques were used to introduce a blunt-end cloning cassette in the replicating HIV-NL4-3 molecular clone in order to clone different V3 sequences from patient virus in the replicative backbone for phenotypic testing. A GFP reporter (engineered as a nef fusion product in the backbone) allowed viral replication to be determined by fluorimetric analysis of CCR5 or CXCR4 expressing cell lines following transfection. Virtual phenotype was obtained by V3-loop RNA genotype-based geno2pheno (G2P) interpretation setting false positive rate (FPR) at 10%. RESULTS: 117 recombinant viruses were obtained from plasma samples of 38 HIV-1 patients. Coreceptor usage was analyzed in all recombinant clones indicating R5 tropism in 90 and DM/X4 tropism in 20 clones corresponding to 28 and 9 patients respectively, not reportable (NR) phenotype was observed in all viral chimerae obtained from 1 of the 38 patients. ESTA was determined in all 38 patients indicating R5 in 25, DM/X4 in 9 and NR in 4. On the whole, there was correspondence between the two biological assays, and between G2P prediction and ESTA. Some discrepancy was observed comparing G2P prediction of the molecular clones and their coreceptor usage CONCLUSIONS: The recombinant phenotypic assay described is highly comparable to ESTA moreover it offers the possibility to dissect the composite phenotype of viral quasispecie at the clonal level providing information about the influence of specific aminoacidic residue. Interestingly, 33% of V3 clonal sequences, predicted as probable X4 by virtual algoritm, conferred an R5 tropism when inserted into NL4-3. The threshold level of FPR should be considered with great attention.
Trofile
Tropismo HIV
Coreceptor usage HIV
File in questo prodotto:
File Dimensione Formato  
Tesi.Monachetti.pdf

non disponibili

Tipologia: Tesi di dottorato
Licenza: Non specificato
Dimensione 1.75 MB
Formato Adobe PDF
1.75 MB Adobe PDF   Visualizza/Apri   Richiedi una copia

I documenti in IRIS sono protetti da copyright e tutti i diritti sono riservati, salvo diversa indicazione.

Utilizza questo identificativo per citare o creare un link a questo documento: https://hdl.handle.net/11566/242310
 Attenzione

Attenzione! I dati visualizzati non sono stati sottoposti a validazione da parte dell'ateneo

Citazioni
  • ???jsp.display-item.citation.pmc??? ND
  • Scopus ND
  • ???jsp.display-item.citation.isi??? ND
social impact