Rigenerazione e trasformazione mediata da A. Tumefaciens di una varietà di pesco Big Top e portinnesto GF677 per indurre la resistenza al virus della vaiolatura delle drupacee (PPU) con costrutti che inducono il silenziamento genico post-trascrizionale

Fruit production represents one of the most important sectors for the Mediterranean area. Often phytopathological problems affect these crops with significant impact on production, quality and related costs. The genetic transformation of fruit trees provides a huge potentiality for the improvement of fruit production and quality and for the obtainment of cultivars with increased resistance to pathogens. The aim of this research was to develop efficient regeneration and genetic transformation protocols to be applied to a variety and a rootstock of peach. The genetic transformation was carried out by optimizing the method already developed for two table grape cultivars (Thompson seedless and Silcora) by Mezzetti in 2002. This method relies on in vitro production of meristematic bulk tissues with a strong capacity to differentiate adventitious shoots via organogenesis. Slices prepared from these bulks were used for Agrobacterium-mediated transformation of peach variety (Big Top) and rootstock (GF677). Selection of putative regenerants was performed on appropriate substrates enriched with the selective agent (Kanamycin) at increasing concentrations (50 mg l-1, 75 mg l-1 and 100 mg l-1). The tissues under selection were each transferred to fresh substrates after 20days (two steps for each concentration) to allow a more efficient selection. The genetic construct used in this transformation method is that which elicits post transcriptional gene silencing (PTGS) in order to induce virus resistance (PPV) or to study gene function. To speed up the screening phase of shoots and observe the development of putative transgenic shoots during the selection phase, a new transformation using a new genetic construct that exploits Green Fluorescent Protein (GFP) was performed. Transformed plants were not obtained after molecular analysis (PCR) and UV screening. Even though the GFP construct 4 lines were positive for PCR using primer for the nptII gene, none was positive when the primer for the GFP gene was used.

Le produzioni frutticole rappresentano un’importante settore produttivo per il mercato dell’area del Mediterraneo. Questo risulta spesso essere penalizzato da problemi di carattere fitopatologico con consistenti ripercussioni sulla produzione, sulla qualità e nei relativi costi. La trasformazione genetica di piante da frutto offre enormi potenzialità per il miglioramento della produzione, della qualità e per l’ottenimento di cultivar con maggiore resistenza ai patogeni. Lo scopo della ricerca è stato quello di sviluppare efficienti protocolli di trasformazione e rigenerazione da applicare ad una varietà ed ad un portainnesto di pesco. La trasformazione genetica è stato effettuata adattando ed ottimizzando il metodo già sviluppato su due cultivar di uva da tavola (Thompson senza semi e Silcora) da Mezzetti nel 2002. Questo metodo si basa sulla produzione in vitro di ammassi meristematici ad elevata capacità di differenziare i germogli avventizi tramite organogenesi. Da questi ammassi vengono preparate delle piccole fettine da utilizzare per la trasformazione mediata da Agrobacterium tumefaciens di una varietà di pesco (Big Top) e di un portainnesto (GF677). La selezione dei putativi transgenici è stata eseguita su appropriati substrati, contenenti l’agente di selezione (Kanamicina) a concentrazioni crescenti (50 mg l-1, 75 mg l-1 and 100 mg l-1). I tessuti in selezione ogni 20 giorni ( due passaggi per ogni concentrazione) sono stati trasferiti su nuovi substrati al fine di ottenere una selezione più efficiente. Il metodo ha previsto l’utilizzato di costrutti genici che inducono il silenziamento genico post-trascrizionale al fine di indurre la resistenza al virus (PPV) e studiarne la funzione genetica. Inoltre per velocizzare la fase di screening dei germogli ed osservarne il loro sviluppo in vitro, durante le fasi di selezione, sono state effettuate delle trasformazioni utilizzando un nuovo costrutto sfruttante la capacità della proteina fluorescente verde (GFP). Dopo aver effettuato le analisi molecolari (PCR) e lo screening con UV non sono risultate piante trasformate anche se con il costrutto (GFP) 4 linee sono risultate positive alle analisi PCR utilizzando la coppia di primer disegnati sul gene nptII ma nessuna utilizzando la coppia di primer disegnati sul gene della GFP.