Relationship between carbon allocation patterns and evolutionary trajectories in marine phytoplankton

Phytoplankton in the extant oceans is mainly dominated by microalgae of the red lineage, with chlorophyll a and c, whereas microalgae of the green lineage, with chlorophyll a and b, only contribute to a minor extent. However, the species composition of phytoplankton changed over geological time scale and microalgae of the green lineage dominated the oceans of the Paleozoic Era, whereas from the Mesozoic Era the red lineage rose to dominance and gave origin to the groups of algae that dominate the extant oceans. This shift in dominance of the phytoplankton has been put in relation with the change of ocean chemistry that occurred over a geological time scale. The oceanic concentration of SO42- increased monotonically from the Paleozoic Era (~1-10 mmol L-1 SO42-) to the present (28 mmol L-1 SO42-). Although it is difficult to have detailed information about the abundances of NO3- and PO4- in the oceans of the past, there are evidences that also the N:P ratios changed over geological time scale, and the oceans passed from P- to N-limitation, from the Paleozoic Era to date. Moreover, the change of the redox state of the oceans caused by the accumulation of the O2 released by photosynthesis from the Neo-Proterozoic to the end of the Paleozoic, determined a change in the abundance of some trace metals, such as Fe, Cu, Mn, Mo, Cd and Zn. It has been hypothesized that the link between the change of ocean chemistry and the evolutionary success of the microalgae of the red lineage is the average cell elemental stoichiometry. The microalgae of the red lineage have been reported to have higher requirement for those elements (S, P, Mn) whose availability increased when the oceans became more oxidized; the opposite was observed for microalgae of the green lineage, which have higher requirement for nutrients less abundant in oxidized conditions (N, Fe, Cu, Zn). This would suggest that the algae of the red lineage are better equipped to cope with the chemical conditions of oxygenated oceans. Because organisms of the same evolutionary lineage share elemental stoichiometry and biosynthetic pathways, they should respond similarly to the variation of nutrient availability, allocating C to the same pools. The pattern of C allocation affects the biology of microalgae through the impact that the energy content exerts on cell palatability and through the effect of the overall cell density on sinking rates. Different organic pools to which C is allocated (i.e. proteins, lipids and carbohydrates) are not equivalent in terms of density and energy requirement. Therefore, on a geological time scale, the patterns of C allocation may have had a relevant role on the evolutionary trajectories of phytoplankton. It can be hypothesized that, in the oxygenated and ecologically permissive oceans that emerged from the Permo-Triassic mass extintction, the algae of the red lineage took advantage of patterns of C allocation that decreased their palatability and allowed a better buoyancy control. The aim of this thesis is to evaluate the impact of the variation of macro- and micro-nutrients availability on the evolutionary trajectories of phytoplankton. In order to pursue this aim, I designed four experiments to investigate the potential role of the following:  Availability of NO3-;  N:P ratio;  Availability of SO42-;  Availability of Fe, Cu and Mn. The first experiment was conducted on ten different species of microalgae belonging to the green and to the red lineage (Amphidinium klebsii, Chlorella marina, Cyclotella meneghiniana, Dunaliella parva, Dunaliella salina, Phaeodactylum tricornutum, Skeletonema marinoi, Tetraselmis suecica, Thalassiosira pseudonana, Thalassiosira weissflogii) and one cyanobacterium (Synechococcus sp.), whereas, for the other experiments a smaller number of species was selected. In partial disagreement with the hypothesis, the patterns of C allocation and their variation in response to changes in the availability of nutrients (NO3-, SO42- and metals) were different in algae sharing the same evolutionary trajectories. Also organisms belonging to the same genus (i.e. Dunaliella parva and Dunliella salina, Thalassiosira pseudonana and Thalassiosira weissflogii) had different patterns of C allocation in response to different NO3- concentrations. On the other hand, the allocation patterns were strongly affected by the cell size. When biomass was characterized in terms of the overall level of reduction, the hypothesis was verified, since the algae belonging to the two evolutionary lineages were consistently distinct. The species of the red lineage showed a lower level of biomass reduction in conditions mimicking the extant oceans, whereas the opposite was true for algae of the green lineage. The higher level of reduction of the green algae in today’s oceans may also translate to a higher energy content and thus a higher palatability of cells to grazers. This may have played a role in favoring the rise to dominance of the algae of the red lineage. The growth rate of the diatom Thalassiosira pseudonana was saturated at a N:P of 13, whereas, the growth rate of the green alga Dunaliella salina was saturated at a N:P of 76. The diatom did not change the rate of assimilation of NO3- as a function of the N:P ratio. The green alga, instead, showed a greater sensitivity to the availability of NO3- and appreciably changed the rate of NO3-assimilation in response to the N:P ratio. The organic composition of T. pseudonana was unaltered in a range of N:P ratio between 2.6 and 13; above this N:P ratio, the diatom modified its composition and increased the cost of biomass production (both remained constant when the N:P ratio was between 38 and 152). Dunaliella salina changed the pattern of C allocation in each culture condition and tended to decrease the energy content of the cell when cultured at higher N:P ratios. Therefore, the diatom spent less energy to produce its biomass in conditions of N availability mimicking those of extant oceans; the green alga, instead, spent less energy when growth in Paleozoic-like conditions. The availability of SO42- affected the growth rates of the diatoms P. tricornutum and T. pseudonana and of the green alga D. salina: when these species were cultured at a SO42- concentration of 28 mmol L-1 (mimicking that of the extant oceans), their growth rates was higher than when they were cultured at a SO42- concentration of 3 mmol L-1 (mimicking that of the Paleozoic oceans). The growth rates of T. suecica was not affected by the availability of SO42-. In the green algae, The N-use efficiency did not change as a function of SO42- availability, whereas that of the diatoms was higher when SO42- concentration was high (28 mmol L-1). Green algae C productivity was higher at low SO42- (3 mmol L-1), but it was lower a high SO42-. The opposite was true for the two diatoms. In P. tricornutum and T. pseudonana, the rate of protein synthesis normalized on RNA amount was appreciably higher at 28 mmol L-1 SO42- than at 3 and 14 mmol L-1 SO42-. The same was not true for the green algae, for which no significant change of this parameter as a function of SO42- concentrations was detected. The two green algae and the two diatoms used in the previous experiment were also cultured in the presence of different Fe, Cu and Mn concentrations. According to the hypothesis that suggests a higher ability of algae of the red lineage to grow in more oxidized environments, an increased availability of Cu and a decreased availability of Fe and Mn should favor these algae over those of the green lineage. Our results do not appear to fully confirm this hypothesis, as the growth response of the four species to the availability of these metals is not consistently related to the evolutionary lineage. In fact, higher Cu availability stimulates the growth of P. tricornutum and of the two green algae, but not of T. pseudonana; higher Fe availability had no effect on the diatoms, but stimulated growth of D. salina; Mn stimulates diatoms growth, but not that of D. salina and T. suecica. In conclusions, the experiments summarized above show that:  The decrease of NO3- availability in the course of Earth history may have favored the algae of the red lineage  The observed decline of the N:P ratio in the oceans across the Mesozoic may also have had a positive impact on the rise to dominance of the algae of the red lineage.  The secular changes in sulfate are compatible with a role of this nutrient in facilitating the prevalence of the red lineage in modern oceans  The change of redox state per se did not impact the evolution of phytoplankton.

1 ABSTRACT Negli oceani attuali, il fitoplancton è principalmente dominato dalle microalghe della linea rossa, con clorofilla a e c, mentre le microalghe della linea verde, con clorofilla a e b, contribuiscono solo in misura minore. Tuttavia, la composizione specifica del fitoplancton è cambiata nel corso dei tempi geologici e le microalghe della linea verde dominavano gli oceani dell’Era Paleozoica, mentre, a partire dall’Era Mesozoica, le alghe della linea rossa diventarono dominanti e diedero origine ai gruppi che sono più importanti negli oceani attuali. Questo cambiamento di dominanza del fitoplancton è stato messo in relazione con la variazione della chimica degli oceani che si è verificata lungo la scala dei tempi geologici. La concentrazione di SO42- negli oceani è aumentata in maniera monotonica dall’Era Paleozoica (~1-10 mmol L-1 SO42-) a oggi (28 mmol L-1 SO42-). Nonostante sia difficile avere informazioni dettagliate sull’abbondanza di NO3- e PO4- negli oceani del passato, ci sono evidenze che anche il rapporto N:P sia cambiato lungo la scala dei tempi geologici, e che gli oceani siano passati dalla limitazione da P a quella da N, dall’Era Paleozoica al presente. Inoltre, il cambiamento dello stato redox degli oceani causato dall’accumulo di O2 rilasciato dalla fotosintesi dal Neo-Proterozoico alla fine del Paleozoico, ha determinato il cambiamento dell’abbondanza di alcuni metalli in tracce, come Fe, Cu, Mn, Mo, Cd e Zn. È stato ipotizzato che la stechiometria elementale media possa essere il link tra il cambiamento della chimica degli oceani e il successo evolutivo delle microalghe della linea rossa. È stato riportato che le microalghe della linea rossa hanno una maggiore richiesta di quegli elementi (S, P, Mn) la cui disponibilità è aumentata quando gli oceani sono diventati più ossidati; il contrario è stato 2 osservato per le microalghe della linea verde, che hanno una maggiore richiesta di nutrienti meno abbondanti in condizioni ossidate (N, Fe, Cu, Zn). Questo suggerirebbe che le alghe della linea rossa siano meglio dotate per far fronte alle condizioni chimiche degli oceani ricchi di ossigeno. Dato che gli organismi della stessa linea evolutiva condividono la stechiometria elementale e i percorsi metabolici, dovrebbero rispondere in maniera simile alla variazione di disponibilità di nutrienti, allocando il C nelle stesse categorie di composti. Le modalità di allocazione del C influiscono sulla biologia delle microalghe attraverso l’impatto che il contenuto energetico esercita sulla palatabilità della cellula e mediante l’effetto della densità cellulare complessiva sulle velocità di affondamento. I differenti composti organici in cui viene allocato il C (proteine, lipidi e carboidrati) non sono equivalenti in termini di densità e di richiesta di energia. Dunque, nella scala dei tempi geologici, le modalità di allocazione del C possono aver avuto un ruolo rilevante sulle traiettorie evolutive del fitoplancton. Può essere ipotizzato che, negli oceani ossigenati e permissivi dal punto di vista ecologico che emersero dall’estinzione di massa Permo-Triassica, le alghe della linea rossa si siano avvantaggiate delle modalità di allocazione del C che ne diminuirono la palatabilità e permisero loro un miglior controllo della galleggiabilità. Lo scopo di questa tesi è valutare l’impatto della variazione della disponibilità dei macro- e micro-nutrienti sulle traiettorie evolutive del fitoplancton. Al fine di perseguire questo scopo, ho pianificato quattro esperimenti per investigare il ruolo potenziale dei seguenti fattori: 3  Disponibilità di NO3-  Rapporto N:P  Disponibilità di SO42-  Disponibilità di Fe, Cu e Mn Il primo esperimento è stato condotto su dieci differenti specie di microalghe appartenenti alle linee evolutive verde e rossa (Amphidinium klebsii, Chlorella marina, Cyclotella meneghiniana, Dunaliella parva, Dunaliella salina, Phaeodactylum tricornutum, Skeletonema marinoi, Tetraselmis suecica, Thalassiosira pseudonana, Thalassiosira weissflogii) e su un cianobatterio (Synechococcus sp.), mentre, per gli altri esperimenti è stato selezionato un numero minore di specie. In parziale disaccordo con l’ipotesi, le modalità di allocazione del C e la loro variazione in risposta ai cambiamenti della disponibilità dei nutrienti (NO3-, SO42- e metalli) erano differenti in alghe che condividono le medesime traiettorie evolutive. Anche gli organismi appartenenti allo stesso genere (Dunaliella parva e Dunaliella salina, Thalassiosira pseudonana e Thalassiosira weissflogii) avevano diverse modalità di allocazione del C in risposta a differenti concentrazioni di NO3-. D’altra parte, le modalità di allocazione del C erano fortemente influenzate dalla taglia cellulare. Quando la biomassa è stata caratterizzata in termini di livello di riduzione complessivo, l’ipotesi è stata verificata, dato che le alghe appartenenti alle due linee evolutive erano marcatamente distinte. Le specie della linea rossa mostravano un livello di riduzione più basso in condizioni che mimano gli oceani attuali, mentre il contrario era vero per le alghe della linea verde. Il maggiore livello di riduzione delle alghe negli oceani attuali si può tradurre in un maggiore contenuto energetico e quindi in 4 una maggiore palatabilità delle cellule per i pascolatori. Questo può aver avuto un ruolo nel favorire l’ascesa alla dominanza delle alghe della linea rossa. Il tasso di crescita della diatomea Thalassiosira pseudonana è stato saturato a un N:P di 13, mentre il tasso di crescita delle alghe della linea verde Dunaliella salina è stato saturato a un N:P di 76. La diatomea non ha cambiato il tasso di assimilazione del NO3- in funzione del rapporto N:P. L’alga verde, invece, ha mostrato una maggiore sensibilità alla disponibilità di NO3- e ha cambiato in maniera apprezzabile il tasso di assimilazione del NO3- in risposta al rapporto N:P. La composizione organica di T. pseudonana è rimasta inalterata in un intervallo di N:P compreso tra 2.6 e 13; per valori di N:P superiori, la diatomea ha modificato la sua composizione e ha aumentato il costo di produzione della biomassa (entrambi sono rimasti costanti quando il rapporto N:P era tra 38 e 152). Dunaliella salina ha cambiato le modalità di allocazione del C in ogni condizione di coltura e ha diminuito il contenuto energetico delle cellule quando è stata coltivata a maggiori rapporti N:P. Dunque, la diatomea ha speso meno energia per produrre la sua biomassa in condizioni di disponibilità di N che mimavano quelle degli oceani moderni; l’alga verde, invece, ha speso meno energia quando è stata cresciuta in condizioni simili al Paleozoico. La disponibilità di SO42- ha influenzato i tassi di crescita delle diatomee P. tricornutum e T. pseudonana e dell’alga verde D. salina: quando queste specie sono state coltivate alla concentrazione di 28 mmol L-1 di SO42- (che 5 mima quella degli oceani attuali), i loro tassi di crescita erano più alti di quando sono state coltivate a una concentrazione di 3 mmol L-1 di SO42- (che mima quella degli oceani del Paleozoico). I tassi di crescita di T. suecica non sono stati interessati dalla disponibilità di SO42-. Nelle alghe verdi, l’efficienza di uso dell’N non è cambiata in funzione della disponibilità di SO42-, mentre quella delle diatomee era maggiore quando la concentrazione di SO42- era alta (28 mmol L-1). La produttività di C delle alghe verdi era più alta a basso SO42- (3 mmol L-1), ma era più bassa ad alto SO42-. Il contrario era vero per le due diatomee. In P. tricornutum e T. pseudonana, il tasso di sintesi delle proteine normalizzato per unità di RNA era considerevolmente maggiore a 28 mmol L-1 di SO42- piuttosto che a 3 mmol L-1 di SO42-. Questo non era vero per le alghe verdi, per le quali non è stato notato nessun cambiamento significativo di questo parametro in funzione delle concentrazioni di SO42-. Le due alghe verdi e le due diatomee usate nei precedenti esperimenti sono state coltivate anche in presenza di differenti concentrazioni di Fe, Cu e Mn. Secondo l’ipotesi che suggerisce che le alghe della linea rossa hanno una maggiore abilità a crescere in ambienti più ossidati, un aumento della disponibilità di Cu e una diminuzione della disponibilità di Fe e Mn dovrebbero favorire queste alghe su quelle della linea verde. I nostri risultati non sembrano confermare pienamente questa ipotesi, dato che le risposte in termini di crescita delle quattro specie alla disponibilità di questi metalli non sono coerentemente correlate alla linea evolutiva. Infatti, la maggior disponibilità di Cu ha stimolato la crescita di P. tricornutum e delle due alghe verdi, ma non di T. pseudonana; la maggior disponibilità di Fe non ha avuto effetto sulle diatomee, ma ha stimolato la crescita di D. salina; il Mn ha stimolato la crescita delle diatomee, ma non quella di D. salina e T. suecica. 6 In conclusione, gli esperimenti riassunti sopra mostrano che:  La diminuzione della disponibilità di NO3- nel corso della storia della terra può aver favorito le alghe della linea rossa  Il declino del rapporto N:P osservato attraverso il Mesozoico può aver avuto un impatto positivo sull’ascesa alla dominanza delle alghe della linea rossa  I cambiamenti secolari dell’abbondanza di SO42- sono compatibili con un ruolo di questo nutriente nell’aver facilitato la predominanza della linea rossa negli oceani moderni  Il cambiamento dello stato redox per se non ha avuto un impatto sull’evoluzione del fitoplancton.