Studio delle fasi cubiche del sistema monoleina-citocromo C-acqua: effetti di composizione, temperatura e pressione

The lipids exhibit a rich lyotropic and thermotropic phase behaviour, due to their amphipatic character : this is a very important point, in fact any variation oh the physico-chemical properties of the lipid component will largely modify the state ad function of the membrane, for example influencing the protein activity. Phase behaviour and structural properties of monoacylglyceride (monoolein) in water have been investigate for a long time, because exhibit an extended polymorphism. In particular, monoolein in water shows several mesophases, characterized by a highly disordered conformation of the hydrocarbon chain.Varying the water concentration a lamellar L-alfa, an inverted (type II) hexagonal phase H II and two bicontinuos inverted cubic phases with space group Pn3m (Q224) and Ia3d (Q230) have been identified. The cubic phases are also unique in their ability to accommodate proteins as compared with other lipid-water phases. A wide range of globular protein with molecular weight 5000-15000 is known to intimately mix in lipid cubic phases, even if in some cases, the protein causes phase transition to occur. Only few ternary lipid-protein-water phase diagram have been completely determined, but the role of protein on the phase transition remain unclear. We was in particular attracted by monoolein-cytochrome C-water, that was studies some time ago. In this system, a cubic-to cubic phase transition occurs when the monoolein is left to equilibrium for several day in excess of a cytochrome C solution: this protein has the unique effect to induce the transformation from the Pn3m to Im3m cubic phase. The monoolein forms the Pn3m cubic phase in excess water, while it forms the Im3m cubic phase in excess of cytochrome C solutions. In this thesis the result of the structural investigation of the monoolein- cytochrome C- water system under variation of concentration of protein, temperature and pressure are discusses. We take advantage of the structural properties of monoolein and cytochrome-c to extensively study the temperature, pressure and concentration of protein effects on the cubic transition from Pn3m to Im3m by means of small-angle X-ray scattering technique (SAXS) and electronic absorption spectroscopy (EAS).Experiments were performed at our laboratory and diffractometer at the synchrotron in Grenoble (ESRF), Hamburg (DESY), Campinas (LNLS) and the unity of physics at the University of São Paulo (Brazil). To do so, we made samples composed of monoolein (50 mg/ml) in the presence of 1,5, 10,25,50 and 100 mg/ml of cytochrome-c. First, we studied the influence of Cytocrome-c concentration on Monoolein phase transition . We started with 25 mg/ml but the concentration was not good enough to perform all the required experiments. So we decided to use 50 mg / ml (Cv mo = 0.614) and cytochrome c concentrations (1, 5, 10, 25, 50, 100 mg/ml). All the measurements were performed dairy from the first up to the twenty-first day after sample preparation, in order to investigate the kinetics of such transition. Interestingly, the protein concentration plays an important role on the monoolein phase transition. All SAXS experiments were performed in Brazil, in the Institute of Physics of the University of Sao Paulo, under the supervision of Prof. Rosangela Itri. The second step was to evaluate the influence of temperature on the system monooleinwater- cytochrome, and observe the difference with the traditional phase diagram of monoolein. The thermotropic structural behavior of the MO/cytochrome was investigated by diffraction temperature scan between 25 and 90°C and this analysis was mad in the Hamburg Synchrotron DESY (Germany) at different days of sample preparation, from the first up to the thirteen day. The temperature analysis is interesting because it provides outline the lipid part and the cytochrome behaviour at room –temperature up to temperature that go over its denaturation status. .In this thesis, high-pressure is used to obtain some contributions to our understanding of biologically relevant molecular structure, in this case monoolein and cytochrome c. This analysis was made in the Grenoble ESRF (France) at different days of sample preparation, at 2 and 8 days. Monoolein- water systems were then used for the new drug delivery technique for treating specific disorders such as Parkinson's disease using monoolein dispersions in water or in the form of Solid Lipid Nanoparticule and cubosomes .Finally, within the channels forming the monoleina were introduced as well as proteins nucleotides also to test their influence on phase transitions.

I lipidi esibiscono un comportamento ricco di diverse fasi liotropiche e termotropiche, a causa del loro carattere antipatiche: questo è un punto molto importante, infatti ogni variazione dei parametri fisicochimici della componente lipidica può portare in gran parte a modificare lo stato di membrana e quindi influenzare l’attività delle proteine presenti.Il comportamento di fase e le proprietà strutturali del monoacilglicerolo (monoleina) è stato investigato da lungo tempo in quanto esibisce un vasto polimorfismo. In particolare la monoleina in acqua mostra diverse mesofasi caratterizzate da un alto grado di disordine conformazionale delle catene idrocarburiche. Variando la concentrazione di acqua si passa da una fase lamellare (L-alfa) ad un’esagonale inversa (H II) a due fasi cubiche bi continue inverse : Ia3d (Q230) e Pn3m (Q224). Le fasi cubiche sono uniche nella loro capacità di inglobare proteine al loro interno, comparare con altre fasi lipidiche. Una grande varietà di proteine globulari con un peso molecolare di circa 5000- 15000 sono intimamente legate alle fasi lipidiche e in alcuni casi ne promuovono la transizione di fase. Solo pochi diagrammi di fase lipide-proteina-acqua sono stati completamente determinati, ma il ruolo della proteina nella transizione di fase non è ancora chiaro. In questa tesi è stato studiato in particolare il sistema monoleina-citocromo c –acqua. In questo sistema avviene una transizione fase cubica- fase cubica quando la monoleina è in equilibrio per alcuni giorni con un eccesso di soluzione di citocromo c. questa proteina ha l’effetto di promuovere la transizione di fase da Pn3m a Im3m (Q229).La monoleina forma la Pn3m in eccesso d’acqua mentre forma Im3m in eccesso di soluzione di citocromo c. In questa tesi lo studio delle variazioni strutturali sono stati condotti variando la concentrazione di proteina e valutando gli effetti della variazione di temperatura e di pressione nella transizione di fase Pn3m a Im3m usando le tecniche del SAXS (Small Angle X Ray Scattering ) e la spettroscopia elettronica di assorbimento (EAS).Gli esperimenti sono stati fatti usando il diffrattometro in dotazione presso il nostro laboratorio e quello del dipartimento di fisica dell’università di San Paolo e la luce di sincrotrone di Grenoble (ESRF), Amburgo (DESY), Campinas (San Paolo-Brasile ). I campioni sono formati da 50 mg/ml di monoleina e diverse concentrazioni di citocromo (1-5-10-25- 50 e 100 mg/ml).In primo luogo, abbiamo studiato l'influenza della concentrazione Cytocrome-C sulla transizione di fase cubica Pn3m formata dalla monoleina.. Abbiamo iniziato con 25 mg / ml di lipide, ma la concentrazione non era sufficiente per effettuare tutti gli esperimenti necessari. Così abbiamo deciso di utilizzare 50 mg / ml (MO Cv = 0,614) e le concentrazioni di citocromo c (1, 5, 10, 25, 50, 100 mg / ml).Tutte le misure sono state eseguite dal primo fino al ventunesimo giorno dopo la preparazione del campione, al fine di indagare la cinetica di tale transizione. È interessante notare che, la concentrazione di proteina gioca un ruolo importante nella transizione di fase monoleina. Tutti gli esperimenti SAXS sono stati effettuati in Brasile, presso l'Istituto di Fisica dell'Università di San Paolo, sotto la supervisione del Prof. Rosangela Itri. Il secondo passo è stato quello di valutare l'influenza della temperatura sul sistema monoleina-acquacitocromo, e osservare la differenza con il diagramma di fase tradizionale della monoleina. Il comportamento strutturale termo tropico del sistema MO / citocromo è stata studiato tramite diffrazione con un range che va dai 25 ai 90 ° C; tale analisi è stata effettuata presso il sincrotrone DESY di Amburgo (Germania) in diversi giorni della preparazione dei campioni, dal primo fino al giorno tredici. L'analisi della temperatura è interessante perché permette di il comportamento della componente lipidica temperature che vanno oltre il suo status di denaturazione delle proteina. In questa tesi,alta pressione è utilizzata per ottenere alcuni contributi sulla comprensione della struttura di sistemi biologicamente interessanti come monoleina e citocromo c.L'analisi è stata effettuata nei laboratori dell’ ESRF di Grenoble (Francia) a diversi giorni dalla preparazione del campione, a 2 e 8 giorni. Sistemi di monoleina e acqua sono stati poi usati per la nuova tecnica del drug delivery per la cura di particolari patologia come il morbo di Parkinson usando dispersioni in acqua di monoleina sotto forma di cubosomi o Solid Lipid Nanoparticules. Infine all’interno dei canali formanti dalla monoleina sono stati introdotti oltre che proteine anche nucleotidi per testare la loro influenza sulle transizioni di fase.