Valutazione degli autoanticorpi contro il recettore del PDGF in pazienti co pre-sclerodermia e della loro relazione con l'attività e la severità di malattia

BACKGROUND Systemic sclerosis (SSc) is an autoimmune disorder characterized by fibrosis of the skin and visceral organs. Its etiology and pathogenesis are still unclear. It has been recently demonstrated that serum of SSc patients contains stimulatory autoantibodies targeting the PDGF receptor alpha (PDGFR) and able to trigger an intracellular signaling pathway involving Ha-Ras stabilization, ERK1/2 phosporylation and NADPH oxidase activation, leading to production of reactive oxygen species (ROS). The overproduction of ROS induces smooth muscle actin and collagen gene transcription, leading to conversion of human normal fibroblasts into myofibroblasts. OBJECTIVES To dissect the immunological repertoire of SSc patients, in order to generate human monoclonal autoantibodies targeting the endogenous PDGFR. METHODS Autoreactive anti-PDGFR memory B lymphocytes obtained from peripheral blood of two SSc patients have been immortalized by infection with Epstein-Barr virus (EBV) and a small panel of clones producing PDGFR-specific IgGs and IgMs has been isolated on the basis of their ability to immunoprecipitate the receptor from the cell membrane of normal human fibroblasts, to induce ROS production and to regulate the expression of genes associated with PDGFR activation. mRNA has been obtained from such positive lymphocyte clones for sequencing and cloning of immunoglobulin variable regions into a human IgG expression vector. These constructs have been expressed in CHO cells to generate fully human monoclonal antibodies. Stable productive clones have been expanded in serum-free medium, recombinant IgGs have been purified from cell culture supernatants by protein A and tested by immunoprecipitation and stimulation experiments to confirm both binding and biological activity on normal human fibroblasts. A C-terminal His-tagged human recombinant PDFGR has been used as target molecule to set up a solid-phase binding assay for the evaluation of the binding properties of the different monoclonal autoantibodies, with surface plasmon resonance (SPR) technique. Homology modeling of the recombinant human IgGs and molecular docking simulation into the human PDGFR have been performed, leading to PDGFR epitope mapping and to the generation and screening of a PDGFR extracellular domain peptide library. RESULTS We have isolated few immortalized memory B lymphocyte clones producing IgGs and IgMs that: i) react with human PDGFR ii) induce Ha-Ras-ERK1/2-NADPH oxidase cascade and ROS production, iii) stimulate type I collagen gene transcription, iv) convert normal human primary fibroblasts into myofibroblasts. Several variable heavy and light chain immunoglobulin sequences have been obtained by cloning selected cDNA fragments from total mRNA. A panel of eight different human monoclonal IgGs containing such sequences has been generated and characterized in terms of structure and biological activity. A preliminary epidemiological study aimed at highlighting differences in the expression of the target immunoglobulin sequences in a small cohort of SSc patients compared with early-scleroderma, Raynaud phenomenon and healthy controls cohorts, in order to correlate them with disease activity and severity, is still ongoing. CONCLUSIONS We have isolated from the immunoglobulin repertoire of SSc patients a small panel of anti-PDGFR autoantibodies able to reproduce in vitro the complexity of the total immunoglobulins present in their serum. We have demonstrated that the agonistic autoantibodies recognize epitopes different from those bound by non-agonistic autoantibodies. These autoantibodies do not only provide proof of principle of the existence of an autoimmune process targeting PDGFR in systemic sclerosis, contributing to the pathogenesis of the disease, but may also serve as biomarkers and offer novel diagnostic and therapeutic strategies.

INTRODUZIONE La sclerosi sistemica (SSc) è una patologia autoimmunitaria caratterizzata da fibrosi della cute e degli organi interni. La sua eziologia e la sua patogenesi sono tuttora sconosciute. Questo studio è ispirato dalla recente scoperta della presenza di anticorpi anti-recettore del PDGF (PDGFR) nel siero di pazienti affetti da SSc. L’importanza di tali autoanticorpi risiede nella loro attività stimolatoria nei confronti del recettore: essi sono infatti in grado di innescare nei fibroblasti una cascata intracellulare che, attraverso l’attivazione delle proteine Ha-Ras, ERK1/2 e NADPH ossidasi, induce una iper-produzione di radicali liberi dell’ossigeno (ROS) e, successivamente, un aumento della trascrizione dei geni del collageno di tipo I e di -actina del muscolo liscio. Il circuito sembra essere in grado di automantenersi anche in assenza dello stimolo anticorpale che l’ha generato. Questo meccanismo può spiegare l’eccessivo stress ossidativo e l’eccessiva produzione di collageno, caratteristiche salienti del fenotipo dei fibroblasti in corso di SSc. OBIETTIVI Scopo di questo lavoro è stato quello di analizzare il repertorio immunoglobulinico della risposta autoimmunitaria nei confronti del PDGFR. Sulla base delle sequenze geniche individuate sono stati generati in vitro anticorpi monoclonali umani ricombinanti anti-PDGFR, con finalità di studio, diagnosi e terapia. MATERIALI E METODI Partendo dal sangue periferico di due pazienti affetti da SSc, abbiamo isolato e immortalizzato, mediante infezione con virus di Epstein-Barr (EBV), i linfociti B memoria IgG positivi . I cloni linfocitari ottenuti sono stati quindi selezionati in base alla loro capacità di produrre anticorpi in grado sia di reagire specificamente contro il PDGFR umano che di indurre la produzione di ROS nei fibroblasti. Da essi è stato estratto l’RNA totale, poi retrotrascritto in cDNA e analizzato in PCR mediante un set di primer in grado di amplificare l’intero repertorio immunoglobulinico umano. Le regioni variabili delle catene pesanti e leggere così identificate sono state sequenziate e successivamente clonate in un apposito vettore plasmidico per essere espresse come IgG umane intere in cellule eucariotiche. Gli anticorpi monoclonali ricombinanti sono stati purificati dai rispettivi sopranatanti di coltura, quindi testati in vitro: i) mediante immunoprecipitazione su lisato totale di fibroblasti umani ottenuti da biopsia cutanea oppure mediante esperimenti di legame competitivo su fase solida, per saggiarne la capacità di interagire specificamente con il PDGFR umano nella sua forma nativa, ii) mediante saggio biologico per la determinazione della produzione di ROS, per valutarne la capacità di generare stress ossidativo, iii) mediante esperimenti di stimolo cellulare, per determinarne la capacità di indurre un’aumentata trascrizione dei geni del collageno di tipo I nei fibroblasti umani normali. La modellazione per omologia della struttura tridimensionale del frammento Fab degli autoanticorpi monoclonali e della regione extracellulare del PDGFR umano, e le analisi di docking molecolare condotte in silico ci hanno inoltre permesso di costruire una library peptidica del PDGFR che è stata poi utilizzata per definire l’epitope mapping. RISULTATI L’analisi del repertorio immunoglobulinico dei cloni linfocitari B memoria autoreattivi nei confronti del PDGFR isolati dal sangue periferico dei due pazienti sclerodermici selezionati ha portato all’identificazione di tre distinte regioni variabili di catene pesanti e di cinque distinte regioni variabili di catene leggere, e all’ottenimento, previa opportuna ricombinazione all’interno di un vettore di espressione plasmidico, di un pannello di otto diverse IgG monoclonali umane. Tali anticorpi monoclonali anti-PDGFR sono stati quindi caratterizzati, in termini di struttura e di attività biologica. E’ ancora in corso la ricerca delle sequenze nucleotidiche delle regioni ipervariabili di tali autoanticorpi in una coorte di pazienti SSc confrontata con coorti di soggetti in fase di pre-sclerodermia, di soggetti con fenomeno di Raynaud e di soggetti normali, al fine di verificare la presenza di differenze statisticamente significative nell’espressione dei geni codificanti alcune delle sequenze immunoglobuliniche d’interesse e di stabilire una correlazione con l’attività e la severità di malattia. CONCLUSIONI Dal repertorio immunoglobulinico di soggetti affetti da SSc è stato isolato un pannello ristretto di autoanticorpi reattivi nei confronti del PDGFR umano, in grado di riprodurre in vitro la complessità delle immunoglobuline presenti nel siero in toto dei pazienti. Abbiamo dimostrato che gli epitopi riconosciuti dagli autoanticorpi agonisti sono distinti da quelli degli autoanticorpi privi di attività agonistica. Tali autoanticorpi costituiscono la prova evidente dell’esistenza nella SSc di un processo autoimmunitario diretto contro il PDGFR, suggerendo un loro ruolo attivo nella patogenesi della malattia, e rappresentano uno strumento prezioso di indagine, con ampia possibilità di applicazione futura in ambito diagnostico e terapeutico.