Caratterizzazione di due anticorpi monoclonali umani cross-neutralizzanti diretti contro la glicoproteina E2 del virus dell'epatite C

In approximately 80% of the cases of infection, hepatitis C virus (HCV) overcomes the host immune response, leading to a chronic infection associated with an increased risk of severe liver diseases. Current therapy (ribavirin and interferon) is expensive, can have adverse side effects and is ineffective for approximately 50% of patients. Despite the genetic variability of the virus at the level of E1E2 envelope glycoproteins, some regions conserved among different E2 genotypes have been described, suggesting that no variability at this level is required to maintain critical functions of the glycoprotein in the life cycle of the virus. Therefore, the identification and characterization of antibodies directed against these regions can theoretically provide a valuable contribution to the creation of an effective vaccine and to the development of passive immunotherapy. In this thesis, two human monoclonal antibody fragments (Fab e20 and Fab e137) directed against the HCV E2 glycoprotein, have been characterized. The antibodies were cloned from lymphocytes of a patient chronically infected with HCV genotype 1b. In order to select crossreactive clones, the library obtained from the patient was screened against a recombinant glycoprotein E2 derived from a different subtype: 1a. In binding experiment, e20 and e137 are capable of binding E2 of all genotypes (e137 is not able to bind genotype 5). Several studies with linear peptides representing different portions of E2, competition assays with antibodies directed against known epitopes and the generation of site-specific mutants of E2 showed that e20 and e137 are directed against a conformational epitope. In particular, the epitope of Fab e20 includes the amino acids: W437, F442, W529, G530 e D535; whereas the epitope of Fab e137 includes the amino acids: T416, W420, W437, L438, L441, F442, W529, G530 e D535.The residues W529, G530, D535 are conserved between different genotypes and involved in the binding of E2 to CD81. Additional tests of competition, between e20 or e137 and CD81, confirmed that the Fabs are directed against a region of E2 important for the binding of virus to cellular receptor. Fab e20 and e137 are able to recognize amino acids within the region 436-447, that is described to bind unneutralizing antibodies, that interfere with the neutralizing antibodies. Furthermore, the data highlight that the epitope of e137 includes two conserved residues (aa 416 and 420) that were described to be within the epitope recognized by mouse monoclonal antibody AP33. The Fab e20 and Fab e137 have a potent cross-neutralizing activity. In the neutralization assay with pseudovirus e20 and e137 neutralize genotypes 1a, 2a and 4 (IC50 approximately 7 μg/mL) and less efficiently genotypes 1b and 2b. The neutralizing activity was also confirmed in a different neutralization assay based on a particular virus isolate that can replicate in vitro (IC50 approximately 2 μg/mL). Finally, the kinetic of neutralization study has shown the ability of the Fab e20 and Fab e137 to inhibit viral infectivity by acting after viral binding to target cells, in particular they are capable of interfering with the events immediately after the binding between virus and low affinity receptor.The data highlight that we identified and characterized two different broadly cross-reacting and neutralizing human monoclonal antibody fragments direct against highly conserved residues of E2 glycoprotein, that are crucial for CD81 binding and HCVpp infectivity. Overall, the availability of cross-reactive monoclonal antibodies with strong neutralizing activity (i) allows a better understanding of the virus-host interplay, (ii) provides new opportunities to develop antigens potentially able to elicit a broadly neutralizing immune response, and (iii) may assist in the development of an effective passive immunotherapy for HCV infection.

Nell’80% dei casi di infezione, il virus dell’epatite C (HCV) supera le difese dell’ospite e stabilisce un’infezione persistente, che espone il paziente al rischio di sviluppare cirrosi e epatocarcinoma. La terapia basata su ribavirina e interferone è costosa, poco efficace e gravata da effetti collaterali. Nonostante la grande variabilità genetica del virus, concentrata soprattutto a livello delle glicoproteine E1E2 dell’envelope, sono state descritte alcune regioni di E2 conservate tra i diversi genotipi, suggerendo che la scarsa variabilità di tali regioni è necessaria per mantenere alcune funzioni cruciali della glicoproteina nel ciclo virale. Pertanto l’identificazione e la caratterizzazione di anticorpi diretti contro queste porzioni conservate di E2 potrebbe fornire un contributo per lo sviluppo di una valida immunoterapia passiva e per la realizzazione di un vaccino efficace. In questa tesi sono stati caratterizzati due frammenti anticorpali monoclonali umani (Fab e20 e Fab e137) diretti contro la glicoproteina E2. e20 ed e137 sono stati clonati dal repertorio linfocitario di una paziente infetta in modo cronico da HCV genotipo 1b. Per selezionare dei cloni potenzialmente cross-reattivi, la library anticorpale ottenuta dalla paziente è stata screenata contro una glicoproteina E2 ricombinante derivata da un sottotipo diverso: 1a. Tramite studi di binding, e20 ed e137 sono risultati in grado di legare E2 di tutti i genotipi (tranne il genotipo 5 per il Fab e137). Esperimenti condotti con peptidi lineari, saggi di competizione con anticorpi diretti contro epitopi noti e la generazione di mutanti sito-specifici di E2 hanno dimostrato che e20 ed e137 sono diretti contro un epitopo conformazionale. In particolar modo, l’epitopo del Fab e20 coinvolge i residui aminoacidici: W437, F442, W529, G530 e D535; mentre quello del Fab e137 coinvolge: T416, W420, W437, L438, L441, F442, W529, G530 e D535. I residui W529, G530, D535 risultano essere conservati fra i vari genotipi e coinvolti nel legame di E2 al CD81. Saggi di competizione fra il Fab e20 o il Fab e137 e CD81 confermano che i Fab sono diretti contro una regione di E2 importante per il legame del virus al recettore cellulare. Si è osservato che i Fab riconoscono dei residui contenuti della porzione della glicoproteina E2 che va dall’aminoacido 436 al 447, regione descritta in letteratura come quella riconosciuta dagli anticorpi non neutralizzati in grado di interferire con l’attività dei cloni neutralizzanti. I nostri dati sembrerebbero contrastare questa affermazione, infatti i Fab e20 ed e137 non solo sono in grado di riconoscere alcuni residui contenuti in questa regione, ma possiedono anche un’attività neutralizzante rilevante. Inoltre il legame del Fab e137 viene abrogato anche da due mutazioni a livello dell’epitopo riconosciuto dall’anticorpo murino AP33, descritto in letteratura come il clone con un ampia cross-reattività ed un’elevata attività neutralizzante. I Fab e20 ed e137 possiedono una potente attività cross-neutralizzante. Nel saggio di neutralizzazione con pseudovirus, e20 ed e137 neutralizzano i genotipi 1a, 2a e 4 (IC50 intorno ai 7 μg/mL) e meno efficientemente i genotipi 1b e 2b. L’attività neutralizzante è stata confermata in un saggio di neutralizzazione basato sull’uso di un particolare isolato virale in grado di replicare in vitro (IC50 intorno ai 2 μg/mL). Grazie agli studi di cinetica di neutralizzazione è emersa la capacità dei Fab e20 ed e137 di inibire l’infettività virale agendo dopo il binding del virus alle cellule bersaglio; in particolare interferiscono con gli eventi immediatamente successivi al legame tra virus e recettori a bassa affinità. Analizzando questi dati, possiamo concludere che abbiamo identificato e caratterizzato due frammenti anticorpali con un ampia cross-reattività ed una potente attività crossneutralizzante, in quanto sono in grado di legare dei residui aminoacidici sulla glicoproteina E2 che svolgono un ruolo chiave nel ciclo virale e che risultano essere conservati tra i vari genotipi. Per cui questi Fab risultano essere fondamentali per lo sviluppo di una immunoterapia passiva efficace e per lo studio dell’interazione virus-ospite.