Selection and analysis of differentially expressed genes in the interaction between Fusarium and Verticillium wilt pathogens and eggplant carrying the Rfo-sa1 resistance locus introgressed from S. aethiopicum

The two fungal wilts caused by Verticillium dahliae (Vd) and Fusarium oxysporum f.sp melongenae (Fom) are among the most serious diseases of eggplant. The resistance locus Rfo-sa1 to Fom was introgressed from the allied specie S. aethiopicum. The expression of resistance to Fom due to the Rfosa1 locus seems also to influence positively the reaction to Vd attack. To better quantify this positive effect, a detailed phenotypical analysis was performed. To this end, three lines carrying the resistance to Fom (All96/6x1F59, All96/6 e 305e40) and the two correspondent recurrent susceptible lines (1F59 e Tal1/1) were employed. The eggplant lines were separately inoculated with Fom Vd, and with both fungi according to 5 different modalities. The evaluation of the symptoms was measured through scoring at 15, 22 and 30 days after inoculation the progression of the disease through the stem (IESF) and the extent and intensity of the foliar symptoms (IAF). The results confirmed that the three genotypes carrying resistance to Fom were fully healthy when inoculated with Fom and, most important, they showed a significant reduction of the IESF and IAF symptoms caused by Verticillium in the mixed inoculations (Fom and Vd) when compared to the inoculation with Vd alone. This proved the improved tolerance to Vd in the eggplants expressing the resistance to Fom. To identificate eggplant genes involved in the eggplant defence response to Fom and/or Vd, three cDNA libraries enriched for Fom-, Vd- and Fom + Vd- modulated genes were constructed from roots of the line All96/6x1F59, using suppression subtractive hybridization (SSH). Almost 1000 clones were selected from the three libraries, sequenced and putative function were assigned on the basis of their significant alignment in the Kegg, Uniprot and Brenda databases. . The expression profile of 50 of these putative differentially expressed genes, chosen on the basis of their function, was performed by means of qRT-PCR validation using a different biological replicate. The outcomes of qRT-PCR analysis showed that expression profiles of most of the genes (mainly belonging to defence response, secondary metabolism and transport and translocation) well correlated with the reaction to fungal wilts. To achive a global vision of the expression profile of all the selected genes a custom microarray was constructed. Our analysis was performed in a new CombiMatrix platform. Changes in gene expression were examined and compared between three different timings (0, 4 and 8 hours after different fungal inoculations. Microarray results were successfully validated using qRT-PCR. The combination of suppression subtractive hybridization (SSH) and microarray analysis followed by a qRTPCR accurate analysis lead to identification of a set of genes involved in eggplant-fungi interaction. These genes represented a group of candidates for further functional genomics studies.

Fusarium oxysporum f. sp. melongenae (Fom) e Verticillium dahliae (Vd) sono funghi vascolari che provocano ingenti danni alle coltivazioni di melanzana sia in serra che in pieno campo. Il locus di resistenza (Rfo-sa1) a Fusarium è stato introgresso da S. aethiopicum in melanzana coltivata (Solanum melongena). Lo studio degli effetti dell’espressione della resistenza a Fusarium oxysporum sulla risposta anche agli attacchi di Verticillium dahliae è stato condotto prendendo in esame sia l’aspetto fenotipico che l’aspetto molecolare. Sono state allestite diverse prove di inoculazione fungina con cinque genotipi di melanzana, tre dei quali resistenti a Fom (All96/6x1F59, All96/6 e 305-E40) e due sensibili a Fom (1F59 e Tal1/1). I diversi genotipi sono stati inoculati con sospensione conidica di Fom, Vd e entrambi i funghi insieme con 5 differenti modalità. L’andamento della malattia è stato valutato rilevando, dopo 15, 22 e 30 giorni dall’inoculazione, l’indice di progressione della malattia lungo il fusto (IESF) e l’indice di alterazione fogliare (IAF). I risultati hanno confermato nei tre genotipi possedenti il locus Rfosa1 di resistenza a Fusarium, c’è totale assenza di sintomi in seguito ad inoculazione con Fom, e , fatto molto più importante, che sintomi nelle inoculazioni miste (Fom e Vd) sono risultati significativamente di minore intensità per IESF e IAF rispetto a quella con solo Verticillium, come osservato in lavori preliminari. Per l’individuazione e lo studio dei geni coinvolti nei meccanismi di interazione funghimelanzana è stata utilizzata la linea All96/6x1F59. Sono state applicate diverse tecniche molecolari: PCR select, qRT-PCR e microarray. E’ stato estratto l’mRNA da campioni di radice di melanzana sottoposti a inoculazione con Fom, Vd e entrambi i funghi contemporaneamente, più un’inoculazione con acqua come controllo. sono state create tre librerie sottrattive (una per ogni inoculazione considerata) a cDNA utilizzando la tecnica PCR select, e il confronto degli spot sui filtri Dot-blot ha permesso di selezionare un totale di circa 1000 cloni come differenzialmente espressi in seguito ad inoculazione. Tutti questi cloni sono stati sequenziati e classificati a livello funzionale. La selezione del gene GAPDH (gliceraldeide fosfato deidrogenasi) come gene housekeeping è stata piuttosto laboriosa. E’ stata quindi svolta la valutazione dell’espressione, mediante qRT-PCR, di cinquanta geni selezionati. Di particolare interesse sono risultati alcuni geni appartenenti alle categorie di meccanismi di difesa, trasporto e metabolismo secondario. E’ stato poi preparato e ibridato un chip microarray Combimatrix, al fine di ottenere una panoramica più ampia sui geni differenzialmente espressi in seguito a inoculazione con i due funghi. I risultati dell’array sono stati validati con la tecnica qRT-PCR. L’analisi comparativa dei dati ottenuti dalle tre tecniche utilizzate (SSH, array e qRT-PCR) ha permesso di selezionare alcuni geni differenzialmente espressi in seguito alle diverse inoculazioni. Questi geni, tutti implicati ai meccanismi di risposta ai patogeni, rappresentano il punto di partenza per l’impostazione di studi di genomica funzionale.