A detailed molecular analysis of the events leading to translation initiation complex formation in Prokaryotes

Protein synthesis is a universally conserved biological process which translates the genetic information into proteins. Translation occurs on the ribosome, a ribonucleoproteic particle composed of two unequal subunits: the small subunit which selects the mRNA and codon-matching tRNAs (decoding process), and the large subunit which catalyzes the peptide bond formation. In E.coli, the selection of the mRNA and the initiator tRNA (fMet-tRNAfMet) is mediated by three initiation factors (IF1, IF2 and IF3) which bind to the small subunit (30S) and coordinate the codon-anticodon base-pairing, yielding the 30S initiation complex (30S IC). The association of the large subunit (50S) leads to the 70S IC formation, which is ready to enter the elongation phase. The purpose of the work presented in this PhD thesis is to provide new insights in the formation of 70S IC. Firstly, the timing of the events triggered by subunits joining has been determined using fast-kinetics techniques, such as light scattering and FRET, yielding the sequence by which initiation factors are released and describing the effects of GTP substitution with the non-hydrolysable analog GDPNP. In the second section, the effects of two base substitutions in the 16S rRNA are described. Mutations C1484U and GGGG773-6CGAU destabilize two of the twelve “bridges” (B3 and B7b) that hold the subunits together and are found to affect subunits association, both in vivo and in vitro, and to decrease the affinity of IF3, which results in a loss of the fidelity function of the ribosome.

La sintesi proteica è un processo biologico universalmente conservato che concretizza l’informazione genetica in proteine. La traduzione ha luogo sui ribosomi, particelle ribonucleoproteiche costituite da due subunità di diversa grandezza: la subunità minore sulla quale avviene la selezione del mRNA e dei tRNA corrispondenti ad ogni codone (processo di decoding), e la subunità maggiore che contiene il sito catalitico che media la formazione del legame peptidico. In E. coli la selezione del mRNA e del tRNA iniziatore è mediata da tre fattori d’inizio (IF1, IF2 ed IF3) che, formando con la subunità minore (30S), il mRNA e i fMet-tRNA il cosiddetto complesso d’inizio 30S (30S IC), coordinano l’interazione tra codone e anticodone e favoriscono l’associazione della subunità maggiore (50S) a formare il complesso d’inizio 70S pronto per iniziare il ciclo di traduzione. Lo scopo di questo progetto di Dottorato è stato quello di approfondire alcuni aspetti della formazione del complesso d’inizio 70S. Nella prima sezione sono presentati esperimenti di formazione di complessi d’inizio 70S in diverse condizioni, utilizzando tecniche di cinetica rapida quali il light scattering e il FRET e componenti dell’apparato traduzionale purificati. I risultati hanno permesso di collocare in un preciso ordine temporale gli eventi che preparano il ribosoma alla fase di estensione. In questo modo è stata ricavata la sequenza con cui i fattori d’inizio vengono rilasciati. Nella seconda sezione è riportata l’analisi degli effetti di due mutazioni a livello del RNA ribosomale (rRNA) 16S (C1484U e GGGG773-6CGAU) che interrompono due delle dodici giunzioni (B3 e B7b) che tengono insieme le subunità durante la fase di estensione. I risultati ottenuti dimostrano che entrambe le mutazioni destabilizzano la struttura del ribosoma riducendo la capacità di associazione delle subunità in vivo e in vitro, e modificando l’affinità per il fattore d’inizio IF3 con conseguenze sulla fedeltà della traduzione.