Studio dell'omeostasi glicemica ed individuazione di un marker precoce di ischemia intestinale nel modello animale di ischemia-riperfusione intestinale

Aims: IRi is the physiopathologic cause of necrotizing enterocolitis. We studied the glycaemic, insulinemic, glucagonemic and cortisolemic changes during IRi (A) (B). To identifying a potential marker of intestinal ischemia we also studied plasmatic changes of miR 499 and miR21 during IRi. Methods: (A) adults Sprague Dawley rats (n=7 IR) underwent 60 minutes of intestinal ischemia and 120 minutes of reperfusion. 6 were used as sham. Blood samples were taken at 30 and 55 minutes of ischemia, and 5,15, 30, 60, 90, 120 minutes of reperfusion. Blood samples were analyzed by rat insulin kit, rat glucagon kit, and rat cortisol kit. (B) adults Wistar young rats (3 IR, 3 sham) and old rats (7 IR, 5 sham) underwent IRi. Blood samples were extracted and analyzed as previous (C) adult Wistar young rats (2 IR, 3 sham) and old rats (6 IR, 2 sham) underwent IRi. Blood samples were extracted and analyzed as previous, and pooled into 3 groups: preoperative, ischemia and reperfusion. miRNA were quantified using qRT-PCR by TaqMan MicroRNA Assay. Results: (A) IRi rats had high glycaemic level (p=0.03) at 60 min of reperfusion, and insulinemic level (p=0.02) at 90 min of reperfusion. No differences were observed in glucagonemic level. Blood cortisol was high at 30 min of ischemia (p=0.02), and 30 (p=0.01), 60 (p=0.001) and 90 (p=0.0008) min of reperfusion. (B) no differences in glycaemic levels between young and old rats. Insulin was higher (p<0.05) in old rats rather than young at 30 min of ischemia. Insulin was higher in young sham in comparison with young rats preoperatively (p<0.05) and at 30 (p<0.05) and 55 (p<0.01) min of ischemia, and 5 (p<0.001), 30 (p<0.05), 60 (p<0.001), 90 (p<0.05) min of reperfusion. No differences among IR rats. No differences in cortisolemic level between old and young rats. (C) old IR and sham rats had miR 499 increase during ischemia and reperfusion. In young rats miR 499 increse durig ischemia and more during reperfusion. In sham young rats miR 499 increse just during reperfusion, and its level is higher than IR ones. miR 499 level increase in young IR and sham rats is smaller than the old IR and sham rats increase. miR 21 increase in old IR rats, durin ischemia and reperfusion, and just during reperfusion in old sham rats. In young IR rats miR 21 decrease, while in sham young rats it decrease during ischemia and increase during reperfusion. miR 21 in youngs is lower than olds. Conclusions: (A) increased glycaemia in IR rats during reperfusion doesn’t depend from cortisol and it’s controlled by insulin. There’s an inappropriate adrenal glands response to IRi, compatible with critical illness-related corticosteroid insufficiency (CIRCI). (B) in sham old rats glycaemia is controlled by insulin, even if insulin levels are higher than young rats ones. No differences between the 2 groups in glycaemia, insulinemia, cortisolemia. (C) miR 499 increase in old IR and sham rats seems to be due to laparotomy. miR 499 seems to be more representative of intestinal ischemia in old rats. In young rats miR 21 decrease could carry to a reduction of its inhibitory function, increasing than inflammation and fibrosis .

Scopo dello studio: l’IRi, rappresenta l’evento fisiopatologico chiave nella patogenesi dell’enterocolite necrotizzante. Nel presente studio abbiamo esaminato le variazioni dei livelli di insulina, glucagone e cortisolo in relazione ai livelli glicemici, durante l’IRi. (A) (B). Al fine di individuare un potenziale marker di ischemia intestinale abbiamo valutato la variazione dei livelli di miR 499 e miR 21 in corso di IRi (C). Metodi: (A) ratti adulti Sprague Dawley (n=7 IR) sono stati sottoposti a 60 minuti di ischemia intestinale e 120 minuti di riperfusione; n=6 ratti sono stati utilizzati come controlli. Prelievi ematici sono stati eseguiti preoperatoriamente e ai tempi 30 e 55 minuti di ischemia e 5, 15, 30, 60, 90, 120 minuti di riperfusione. I campioni di sangue sono stati analizzati dosando la glicemia e utilizzando il rat insulin kit, rat glucagon kit, rat cortisol kit. (B) ratti adulti Wistar giovani (young; 3 IR, 3 controlli) e anziani (old ; 7 IR, 5 controlli) sono stati sottoposti a IRi. I prelievi di sangue e i campioni ematici sono stati estratti ed analizzati come indicato in precedenza (C) ratti adulti Wistar giovani (young; 2 IR, 3 controlli) e anziani (old, 6 IR, 2 controlli) sono stati sottoposti a IRi. I prelievi di sangue sono stati effettuati nei tempi indicati in precedenza e combinati in 3 gruppi (preoperatorio, ischemia e riperfusione). I miRNA sono stati quantificati tramite qRT-PCR usando il TaqMan MicroRNA Assay. Risultati: (A) i ratti sottoposti a IR hanno presentato valori significativamente superiori di glicemia (p=0.03) a 60 minuti di riperfusione e di insulinemia (p=0.02) a 90 minuti di riperfusione, mentre non sono state osservate differenze nei valori ematici di glucagone. La cortisolemia è risultata significativamente maggiore nel gruppo controllo a 30 minuti di ischemia (p=0.02) e 30 (p=0.01), 60 (p=0.001) e 90 (p=0.0008) minuti di riperfusione. (B) Non sono state osservate differenze nella variazione dei livelli di glicemia nei ratti giovani e anziani. L’insulinemia è risultata maggiore (p<0.05) nel gruppo IR old rispetto agli IR young nel prelievo effettuato a 30 minuti di ischemia. Il gruppo old controllo ha presentato valori superiori di insulina, rispetto al gruppo young controllo, preoperatoriamente (p<0.05), a 30 (p<0.05) e 55 (p<0.01) minuti di ischemia, e a 5 (p<0.001), 30 (p<0.05), 60 (p<0.001), 90 (p<0.05) minuti di riperfusione. Non sono state osservate differenze nei valori plasmatici di glucagone nei ratti sottoposti a IRi, Non sono state osservate differenze nella variazione dei livelli di cortisolemia nei ratti giovani e anziani. (C) Nei ratti old IR e old controllo, il miR499 tende ad aumentare durante la fase di ischemia e di riperfusione. Nei ratti young IR il miR499 aumenta durante l’ischemia, e ancor più in fase di riperfusione. Nei ratti young controllo, il miR499 aumentano solo in fase di riperfusione, e supera i livelli del gruppo IR. Il miR 499 del gruppo IR e del gruppo controllo sono inferiori rispetto alle corrispondenti serie del gruppo old. Il miR 21, nei ratti old IR, ha una forte tendenza all’aumento, sia in fase di ischemia che di riperfusione, mentre nei ratti old controllo esso aumenta solo in fase di riperfusione. Nei ratti young IR, il miR 21 mostra un trend in decremento, mentre nei controlli i suoi livelli si riducono in fase di ischemia e aumentano durante la riperfusione. Il valore del miR 21 IR e controllo è inferiore al rispettivo del gruppo old. Conclusioni: (A)l’aumento della glicemia in fase di riperfusione nel gruppo IR non sembra dipendere dalla stimolazione cortisolemica e viene controllata da un’adeguata risposta insulinica. E’ presente una inadeguata risposta surrenalica all’Iri, compatibile con un quadro di critical illness-related corticosteroid insufficiency (CIRCI). (B) In condizioni normali nel ratto anziano la glicemia sembra essere controllata in modo adeguato dalla secrezione di insulina, anche se la quantità richiesta per mantenere livelli glicemici ottimali è superiore rispetto a quella secreta dai ratti giovani. Non ci sono differenze tra i due gruppi per quanto riguarda glicemia, insulinemia e cortisolemia. (C) l’aumento del miR 499 nei ratti old, sia IR che controllo, sembra essere dovuto alla laparotomia addominale. Negli old, rispetto agli young, il miR 499 assume un ruolo più specifico di marcatore di necrosi intestinale. Negli young IR, la riduzione del miR 21 potrebbe causare una riduzione della sua funzione inibitoria, sia nell’infiammazione, che nello sviluppo di fibrosi.