Studio della risposta anticorpale umana protettiva nei confronti di un ampio spettro di virus influenzali attraverso il clonaggio e la caratterizzazione di anticorpi monoclonali umani

Influenza is a serious public health problem that causes severe illnesses and an estimated 250000 to 500000 deaths worldwide every year. During a seasonal epidemic, pre-existing immunity, due to prior infection or vaccination with previous seasonal viruses, can only offer a partial protection since the raising of antigenic mutations in the viral envelope glycoproteins. This phenomena is known as antigenic drift. The emergency of a new influenza virus, distinct from the already circulating viruses, is known as antigenic shift and may lead to a pandemic. Although rare,pandemics are events that can potentially cause high level of morbidity and mortality due to absence or low pre-existing immunity in the human population. It has been widely demonstrated that humoral immune response plays a key role in controlling influenza virus infection. Passive immunization has been reported to be effective against H1N1 and H5N1 viruses suggesting that antibody treatment could represent a potential approach to prevent and treat influenza infection. This study describes the molecular cloning, the binding characteristics and the broad-range neutralizing activity of two human monoclonal antibodies (mAbs) named PN-SIA28 and PNSIA49. When tested in immunofluorescence assay, both PN-SIA28 and PN-SIA49 were able to bind cells infected with all the H1N1 strains tested, including the H1N1 2009 pandemic virus. Additionally, PN-SIA28 was also able to bind cells infected with the H3N2 strains tested. No reactivity was demonstrated against the B/Lee/40 strain. Cells transfected with the recombinant hemagglutinin (HA) gene of A/Puerto Rico/8/34 or A/South Carolina/1/18 were recognized by both PN-SIA28 and PN-SIA49, thus suggesting that these antibody bind to a conserved antigenic epitope in the HA. Western blotting analysis showed that the epitope recognized by both mAbs is present only in the HA0 form of hemagglutinin and, in competition experiments, both PN-SIA28 and PNSIA49 are displaced by the mouse monoclonal antibody C179, that recognizes a conformational epitope in the HA stem region. These data indicate that the epitope recognized by the two mAbs is situated on the stem region of the HA. PN-SIA28 and PN-SIA49 neutralize all the H1N1 strains used in this study. Moreover, PN-SIA28 has a potent neutralizing activity against different H3N2 strains. No neutralizing activity was demonstrated against the B/Lee/40 influenza B strain In conclusion, PN-SIA28 and PN-SIA49 are able to bind and neutralize a broad range of H1N1 viruses, including the H1N1 2009 pandemic virus. PN-SIA28 is also able to bind and neutralize H3N2 subtype viruses. This study will progress with the detailed characterization of the HA region involved in PNSIA28 and PN-SIA49 binding to the HA that may help to identify conserved epitopes shared between different influenza virus subtypes and to develop innovative broad range vaccination strategies.

L’Influenza rappresenta un grave problema di salute pubblica che può portare a condizioni patologiche severe e causa da 250000 a 500000 morti ogni anno nel mondo. Durante le epidemie stagionali, l’immunità pre-esistente, dovuta ad una precedente infezione o alla vaccinazione con virus della precedente stagione, può fornire solo una protezione parziale a causa dell’insorgenza di mutazioni antigeniche nelle glicoproteine del pericapside virale. Questo fenomeno prende il nome di deriva antigenica. La comparsa di un nuovo virus influenzale, distinto dai virus comunemente circolanti, è conosciuta con il nome di spostamento antigenico e può causare pandemie. Sebbene rare, le pandemie sono eventi che, potenzialmente, possono essere associate ad elevati tassi di morbilità e mortalità a causa dell’assenza o dei bassi livelli di immunità pre-esistente nella popolazione umana. È stato ampiamente dimostrato che la risposta immune umorale svolge un compito rilevante nel controllare l’infezione da virus influenzale. L’immunizzazione passiva è risultata efficace contro i virus H1N1 e H5N1 suggerendo che il trattamento con anticorpi può rappresentare un potenziale approccio per prevenire e trattare l’infezione influenzale. Questo studio descrive il clonaggio molecolare, le caratteristiche di legame e l’attività neutralizzante di due anticorpi monoclonali umani denominati PN-SIA28 e PN-SIA49. In saggi di immunofluorescenza, sia PN-SIA28 che PN-SIA49 riconoscono cellule infettate con tutti i sottotipi H1N1 testati, incluso il virus H1N1 della pandemia del 2009. Inoltre, PN-SIA28 lega anche cellule infettate con i virus di sottotipo H3N2 testati. Nessuna reattività è stata dimostrata contro il ceppo B/Lee/40. Cellule trasfettate con il gene dell’emoagglutinina (HA) del virus A/Puerto Rico/8/34 o A/South Carolina/1/18 sono riconosciute sia da PN-SIA28 che da da PNSIA49,suggerendo che questi anticorpi legano un determinante antigenico conservato nella HA. L’analisi tramite Western Blotting ha mostrato che l’epitopo riconosciuto da entrambi gli anticorpi è presente solo nella forma HA0 dell’emoagglutinina e, in saggi di competizione, sia PN-SIA28 che PN-SIA49 sono spiazzati dall’anticorpo monoclonale murino C179, che riconosce un epitopo conformazionale situato sulla regione stem della HA. Questi dati indicano che, anche, l’epitopo riconosciuto dai due anticorpi è situato sulla regione stem della HA. PN-SIA28 e PN-SIA49 neutralizzano tutti i sottotipi H1N1 utilizzati in questo studio. Inoltre, PN-SIA28 ha una potente attività neutralizzante contro diversi virus di sottotipo H3N2. Nessuna attività neutralizzante è stata osservata contro il ceppo influenzale di tipo B, B/Lee/40. In conclusione, PN-SIA28 e PN-SIA49 sono in grado di legare e neutralizzare un ampio spettro di virus influenzali di sottotipo H1N1, compreso il virus pandemico del 2009. PN-SIA28 è anche in grado di legare e neutralizzare virus di sottotipo H3N2. Lo studio proseguirà con la caratterizzazione dettagliata della regione della HA coinvolta nel legame con PN-SIA28 e PN-SIA49 che potrebbe aiutare ad identificare epitopi conservati condivisi tra differenti virus influenzali e a sviluppare strategiae vaccinali ad ampio spettro.