L'enzima nicotinamide N-Metiltrasferasi: un nuovo marker diagnostico e target terapeutico nel carcinoma orale

Oral squamous cell carcinoma (OSCC) is the most common malignancy of oral cavity. In recent 50 years, despite the advances in surgery and adjuvant therapies, the 5-year mortality rate of oral cancer is about 50% around the world. Up to now, reliable biomarkers for OSCC are still lacking. Therefore, it is necessary to identify target molecules for effective therapy and for early diagnosis of OSCC. In the present study, we focused on the expression of Nicotinamide N-Methyltransferase (NNMT), which catalyses the N-methylation of nicotinamide, pyridines and other structural analogs, playing an important role in the biotransformation and detoxification of many xenobiotics. Several tumours have been associated with abnormal NNMT expression. However its role in tumour development remains largely unknown. To explore the involvement of NNMT in OSCC, we analysed the enzyme expression in tumour and non-tumour oral tissues obtained at surgery by RT-PCR, Real-Time PCR, Western blot, immunoistochemical analysis and catalytic activity assay. We also evaluated the effect of shRNA-mediated inhibition of NNMT on the proliferative potential of an oral cancer cell line. Transfected and normal oral cells were injected into athymic mices in order to evaluated the effect of NNMT silencing on tumour growth. The results showed a significant increase of NNMT expression (tumour tissue vs normal mucosa) in most of the favourable OSCCs (N0), while no marked NNMT expression alteration between tumour and normal mucosa was detected in most of metastatic tissues (N+). Immunohistochemical analyses performed on paraffin-embedded samples of oral cancer and normal mucosa indicated a significant NNMT upregulation in the examined OSCCs, that was more evident in well- and moderately-differentiated cases than in undifferentiated ones. Consistent with the results of immunoistochemistry, NNMT specific activity values were significantly higher in OSCCs than in control samples. ShRNA vectors targeted against NNMT efficiently suppressed gene expression, showing an inhibition rates around 70%, observed at both the mRNA and protein levels. Down-regulation of NNMT significantly inhibited cell proliferation and decreased colony formation ability on soft agar. In athymic mices NNMT silencing effectively induced a drastic reduction in tumour volume, suggesting the involvement of the enzyme in cancer development. The present data support the hypothesis that NNMT plays a role in oral carcinogenesis and represents a highly promising marker for early detection of oral cancer. The results obtained from silencing and in vivo experiments seem to suggest that NNMT is involved in cell proliferation and its inhibition could represent a possible molecular approach to the treatment of oral cancer.

Il carcinoma squamocellulare (OSCC) rappresenta la lesione neoplastica più frequente nella cavità orale. Nonostante i progressi effettuati in campo sia chirurgico sia terapeutico, la sopravvivenza media a 5 anni si mantiene ancora al di sotto del 50%. La ricerca di marcatori molecolari coinvolti nella progressione neoplastica risulta essere quindi di primaria importanza. In relazione a studi precedentemente condotti, che hanno portato all’identificazione dell’enzima Nicotinamide N-metiltrasferasi (NNMT) quale potenziale marker di alcune tipologie di tumore, è risultato interessante intraprendere uno studio dell’espressione dell’NNMT nel carcinoma orale squamocellulare. Tale analisi è stata condotta su campioni di tessuto orale sano e canceroso relativi a pazienti affetti da OSCC, affrontando uno studio sia a carico del mRNA mediante RT-PCR e Real-Time PCR, sia a carico della proteina mediante Western blot, analisi immunoistochimiche e saggio di attività enzimatica. Allo scopo di esplorare il coinvolgimento dell’NNMT nel metabolismo della cellula tumorale, sono stati successivamente effettuati esperimenti di silenziamento dell’enzima in una linea cellulare di carcinoma orale; le cellule trasfettate e quelle di controllo sono state in seguito inoculate in topi nudi. I risultati ottenuti hanno consentito di osservare un aumento significativo dell’espressione dell’NNMT (tessuto tumorale vs mucosa sana) nella maggior parte dei soggetti privi di metastasi, mentre nei casi che presentavano metastasi linfonodali l’NNMT non sembrava subire marcate alterazioni della sua espressione. L’analisi immunoistochimica ha confermato l’overespressione della proteina nei campioni di OSCC rispetto ai campioni di mucosa sana dove il segnale era quasi o del tutto assente. Inoltre l’aumento di espressione dell’NNMT risultava più marcato nei campioni di tumore moderatamente o ben differenziato rispetto ai campioni di tumore indifferenziato. I risultati ottenuti mediante saggio di attività catalitica hanno indicato un aumento dei livelli di attività dell’enzima nel tessuto tumorale nella quasi totalità dei campioni esaminati. Il silenziamento dell’NNMT effettuato su cellule di carcinoma orale ha comportato una diminuzione della crescita cellulare e della capacità di formare colonie in assenza di adesione al substrato. Gli esperimenti condotti sui topi atimici hanno mostrato come l’inoculo delle cellule trasfettate nelle quali il gene NNMT era stato silenziato determinava la formazione di masse tumorali di dimensioni marcatamente ridotte rispetto a quelle ottenute in seguito all’inoculo delle cellule di controllo. L’elevata espressione dell’NNMT nel carcinoma squamocellulare sembrerebbe indicare che l’enzima possa svolgere una funzione importante nel processo di oncogenesi orale. L’esistenza di una correlazione inversa tra i livelli di espressione dell’NNMT in OSCC (tumore versus mucosa sana) e la presenza di metastasi supporta l’ipotesi secondo la quale l’enzima possa svolgere un importante ruolo nell’invasione neoplastica, candidandolo a potenziale marcatore prognostico di tale neoplasia. L’identificazione di una correlazione inversa tra i livelli di espressione dell’NNMT e il grado istologico suggerisce un possibile ruolo dell’enzima nelle fasi iniziali dell’oncogenesi. I risultati delle analisi di attività enzimatica consentono inoltre di candidare l’NNMT quale possibile marcatore diagnostico di tale tipologia neoplastica. I risultati ottenuti in seguito agli esperimenti di silenziamento ed analisi in vivo evidenziano un coinvolgimento dell’enzima NNMT nella proliferazione cellulare. Il silenziamento di tale enzima comporta infatti una riduzione della capacità proliferativa e del potenziale tumorigenico della cellula neoplastica; la sua inibizione potrebbe quindi rappresentare un possibile approccio molecolare alla terapia del carcinoma orale.